摘要：目的 探讨乙型肝炎病毒x蛋白（HBX）对脂质代谢相关基因的影响及其在肝细胞脂肪变性发生中的作用。方法将质粒pIRES2-eGFP—HBX转染入hepg2细胞中，建立表达HBX的hepg2／HBx细胞模型；以转染空载体plRES2-eGFP（hepg2／pIRES2细胞）及未转染的hepg2细胞作为对照。转染后24、48、72h，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达；检测细胞内甘油三酯含量；RT—PCR方法检测固醇调节元件结合蛋白I（SREBP-1）和肝x受体（LXR）αmRNA表达水平；WesternMot检测HBX，LXRa及脂肪酸合成酶（FAS）蛋白表达的变化。多组间比较采用成组设计的方差分析，多组间的两两比较采用q检验；各基因表达量之间的关系采用Pearson相关分析。结果在转染后24、48、72h，hepg2／HBx细胞和hepg2／DIRES2细胞中有GFP的表达并随时间延长而增多、增强，仅在hepg2／HBx细胞内有HBx表达，并且随时间的延长而逐渐增加，差异有统计学意义（F=32．21，P〈0．05），提示成功建立hepg2／HBx细胞模型；在转染后24、48、72h，hepg2／HBx细胞内LXRamRNA相对表达量分别为0．386±0．055、0．505±0．071、0．649±0．058，SREBP-1mRNA相对表达量分别为0．395±0．055、0．548±0．047、0．795±0．058；LXRG[蛋白的相对表达量分别为0．178±0．036、0．263±0．047、0．347±0．058，FAS蛋白相对表达量分别为0．436±0．055、0．608±0．053、0．827±0．046，各相同时间点均较对照组明显增加（P〈0．05或JD〈0．01），并均随时间的延长而逐渐增多（P〈0．05或P〈0．01），且与HBX表达量均呈正相关（rLXRa=0．994，rsREBP-1=0．984，r’LXRa=0．989，rFAS=0．991，P〈0．05）。hepg2／HBX细胞内TG含量与对照组相比，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论HBx-LXRa-SREBP-1／FAS通路可能参与了调节脂质代谢相关基因的转录和表达，可能是引起肝细胞脂肪变发生的重要分子机制之一。

摘要：目的:构建靶向乙肝病毒X基因(HBX)的shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,并应用其体外抑制HBX促hepg2细胞凋亡的作用。方法:设计并构建靶向HBX的shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,脂质体转染法将HBX表达载体pcDNA3.1-HBX与pSilencer3.1-shHBX共转染人肝癌hepg2细胞,培养72小时后,分别以RT-PCR、Western blot和免疫荧光检测HBX的表达量。Annexin V-FITC/PI双染经流式细胞仪检测细胞的凋亡变化。结果:重组质粒pSilencer3.1-shHBX酶切鉴定和测序结果均与设计的一致。该质粒使HBX基因mRNA表达量降低了47.1%,进而使HBx蛋白表达量降低了58.9%,HBx蛋白荧光强度减弱,并使HBX诱导的hepg2细胞凋亡率降低了52.11%。而阴性对照质粒无此作用。结论:成功构建靶向HBXshRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,并可应用其抑制HBX促hepg2细胞凋亡的作用。

摘要：目的　研究siRNA对肝癌细胞株hepg2中Survivin基因表达的抑制作用。方法　设计、合成一对Survivin编码基因的反向重复序列 ,中间间隔 9个核苷酸序列 ,通过定向克隆至载体Psilencer2 1,构建siRNA真核表达载体 ,经稳定转染hepg2细胞后应用RT PCR及流式细胞术检测肝癌细胞中Survivin基因mRNA及蛋白质表达的抑制情况。结果　测序证实siRNA真核表达载体构建成功。通过RT PCR及流式细胞术检测 ,siRNA在mRNA及蛋白质水平抑制Sur vivin基因表达分别达 73%和 75 %。结论　构建的Psilencer (+) Survivin重组质粒能有效抑制Survivin基因在肝癌细胞株hepg2中的表达。为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法和材料。

摘要：目的:以Plk1基因为靶筛选抗肿瘤药物。方法:根据Plk1mRNA的二级结构设计8条反义寡核苷酸药物,以脂质体介导进行转染,MTT染色计算细胞生长抑制率,从中筛选出一条序列并对其进行优化。最后以最佳序列9号进行体外作用持续时间及裸鼠移植瘤细胞生长抑制率分析。结果:针对5'编码区的5号序列在0.2μmol/L、0.4μmol/L和0.8μmol/L时抑制率分别是59.1%、75.5%和90.7%。它抑制细胞增殖作用最强。5号序列的5'端向内移动3个碱基形成的9号序列的抑制率高于其它3条序列,9号的IC50是0.081μmol/L。终浓度为0.2μmol/L的9号药物经脂质体介导转染给药1次后,抑制活性逐渐增加,第4天抑制率达到93.0%的峰值,然后缓慢下降,到第6天抑制率为78.3%。荷瘤裸鼠每日腹腔注射9号药物(25mg/kg)用药28天,处死时对照组的瘤重为(1.536±0.196)g,用药组瘤重为(0.485±0.378)g,方差分析表明用药组与对照组相比有显著性差异(t=5.59P<0.01),用药组抑瘤率达68.42%。结论:靶向Plk1的反义治疗能够抑制肿瘤的生长,对正常细胞无明显毒性。Plk1可作为肿瘤治疗的新靶点。

摘要：目的利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制肝癌相关基因BC047440的表达,观察其受抑制后对细胞增殖能力的影响并初步分析其抑制增殖的分子机制。方法设计针对BC047440基因的siRNA,构建pGenSil-1-BC047440-siRNA真核表达载体。分别用脂质体法将介导siRNA的真核绿色荧光表达载体pGenSil-1-BC047440-siRNA、空载体质粒pGenSil-1转染人肝癌hepg2细胞建立稳定细胞株;随后实验分为3组:转染siRNA表达载体组(PP2)、转染空质粒组(PP1)和未处理的亲本hepg2细胞组(PP0)。采用荧光定量PCR检测BC047440mRNA表达变化;CCK-8分析细胞增殖活性;平板克隆形成实验检测单个细胞的增殖能力;最后选取NF-κB下游增殖相关基因c-myc、bcl-2、cyclin D1,用荧光定量PCR检测其mRNA水平的变化。结果成功转染并获得PP1、PP2组抗性克隆,PP2组与PP0组比较,BC047440mRNA水平明显降低,抑制率约为75%;细胞增殖实验中PP2组细胞增殖能力明显降低,平板克隆形成实验结果显示PP2组克隆形成率为(8.42±0.82)%,明显低于PP1组[(39.31±5.39)%]和PP0组[(40.96±3.21)%](P<0.01)。检测NF-κB下游增殖相关的几个基因时发现PP2组c-myc mRNA表达明显降低,约为PP0组的12/25;其余基因无明显变化。结论干扰BC047440基因表达可以抑制肝癌细胞的增殖,初步揭示BC047440基因可以对c-myc起正向调控作用,从而促进肝癌细胞的增殖,提示抑制BC047440基因可能成为控制人肝癌细胞生长的有效靶点。

摘要：目的观察BC047440基因能否通过增强NF-κB的活化而促进hepg2细胞的增殖。方法设计针对BC047440基因的小干扰RNA(siRNA),构建pGenesil-1-BC047440-siRNA真核表达载体,用脂质体法将介导siRNA的真核绿色荧光表达载体pGenesil-1-BC047440-siRNA、pGenesil-1-HK-siRNA转染人肝癌hepg2细胞建立稳定细胞株;实验分为3组:转染siRNA表达载体组、无关质粒组和未处理的亲本hepg2细胞组。采用平板克隆形成实验分析细胞的增殖活性,通过Western blot检测细胞质p50含量,EMSA检测NF-κB的核转位,荧光素酶试验检测各组细胞的NF-κB活化情况。结果细胞增殖实验显示转染siRNA组细胞增殖能力明显降低,BC047440基因沉默后的hepg2的细胞质p50含量低于野生株hepg2,NF-κB核转位低于野生株hepg2,其荧光素酶和海肾荧光素酶活性比值只有野生株的1/4。结论BC047440基因能促进肝癌细胞的增殖,其调节机制可通过NF-κB信号途径实现,提示BC047440基因可能成为抑制人肝癌细胞生长的有效靶点。

摘要：目的:通过siRNA干扰技术研究TGFBR2基因沉默对hepg2细胞增殖的影响。方法:设计3种针对TGFBR2基因的siRNA片段,瞬时转染进hepg2细胞中;挑选出沉默效率最高的siRNA片段,并将对应的DNA序列插入到pEGFP-N3质粒中,再将质粒转染到hepg2细胞中,检测TGFBR2蛋白表达水平。用TGF-β1刺激siRNA干扰后的hepg2细胞,对比干扰前后细胞增殖的变化。结果:在3种siRNA片段中,siRNA-1的沉默效率最高。用5 ng/mL的TGF-β1刺激hepg2细胞,与blank组和siRNA-NC组比较,siRNA-1组细胞增殖加快(P<0.05),但仍低于未加TGF-β1因子的正常hepg2细胞(P<0.05)。结论:通过siRNA技术沉默TGFBR2基因后,可减弱TGF-β1信号传导通路对hepg2肝癌细胞株的抑制作用,导致肿瘤细胞的增殖加快。

摘要：目的优选hepg2细胞最佳培养条件。方法分别以培养基、细胞接种密度、血清含量、双抗浓度、pH、Hanks清洗次数、胰酶浓度和消化时间为量化指标设计正交试验,SPSS11.0统计软件分析,得方差分析及多重比较结果。结果含15%胎牛血清的DMEM培养基,接种密度为4&#215;104个/mL,双抗浓度为0.5%,pH为7.2;在汇合度达95～100%时,Hanks洗3次,0.05%胰酶-EDTA-Na2H2O消化1min,传代效果最好,条件易于控制,且细胞能顺利生长。结论本法为hepg2细胞最佳培养条件的确定提供了可靠的实验数据。

摘要：目的探索通过小激活RNA(saRNA)调控钠碘转运体(NIS)基因特异性表达介导肝癌核素显像和治疗的可行性,为RNA激活(RNAa)技术介导核素基因治疗肿瘤的应用提供实验依据。方法 saRNA的设计合成:通过基因BLAST比对,设计与合成三条针对NIS基因的saRNA序列;细胞转染:以LipofectaminTM2000为saRNA载体,将saRNA转染到肝癌Hep G2细胞后72h,采用Western blotting分析NIS蛋白的表达水平,筛选出RNAa效率最高的saRNA,并进一步分析saRNA转染后不同时相NIS的表达水平,以及saRNA浓度-NIS表达水平的浓度-效应关系;体外核素摄取实验:体外培养条件下,评价转染肝癌Hep G2细胞对125I的摄取;细胞生长增殖抑制实验:体外培养条件下,评价131I对转染肝癌细胞的生长抑制率。结果 saRNA可上调NIS基因表达水平,其中saRNA482序列上调NIS表达水平最高;saRNA上调NIS的峰值出现在转染后72h,NIS维持高表达水平在10d以上;且NIS上调水平随saRNA浓度增高而增高。体外培养条件下,转染细胞与未转染细胞的摄碘水平差别明显,其中最高者摄碘较对照细胞高出64倍。体外培养条件下,相对未转染组肝癌细胞,131I对转染组Hep G2细胞的生长抑制率为60.7%。结论本研究设计合成的靶向NIS基因的saRNA可上调肝癌细胞NIS的表达水平,增强肝癌细胞摄取放射性碘的能力,研究还证实,通过RNAa调控NIS基因表达可介导131I治疗肝癌的潜力。

摘要：目的:鉴定肝癌细胞系hepg2中survivin异构体(survivin variant,SVV variant)并构建其真核表达载体。方法:提取hepg2细胞总RNA,根据Gen-Bank内survivin 3个异构体核苷酸序列设计3条引物对其进行鉴定;设计含有BamHⅠ和XhoⅠ双酶切位点的SVV-3引物,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增SVV-3完整编码区,扩增产物用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达栽体pcDNA3.1中,序列测定进行鉴定。结果:hepg2细胞表达SVV-3、1,SVV-3表达尤为丰富。对SVV-3克隆测序,与Gen-Bank报道完全一致。结论:成功鉴定出hepg2表达SVV-3、1,构建了SVV-3真核表达载体。