摘要：目的:设计特异性结合乙肝病毒核心启动子(HBVCp)的锌指蛋白(ZFP),观察ZFP在体外对HBV转录的抑制情况。方法:利用Zinc finger tools设计特异性结合HBV Cp的ZFP。将ZFP核苷酸序列人工合成后克隆至pEGFP-N1和pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pEGFP-N1/ZFP-Flag和pcDNA3.1(+)/ZFP。通过倒置荧光显微镜、RT-PCR和Western blot鉴定pEGFP-N1/ZFP-Flag在COS-7中的表达情况;将pcDNA3.1(+)/ZFP转入hepg2.2.15细胞后24 h,采用ELISA和FQ-PCR检测上清液中HBeAg和HBV DNA含量,RT-PCR检测细胞内HBV mRNA水平。结果:ZFP在COS-7细胞中能正常表达。与空质粒组相比,ZFP组细胞培养上清液中HBV DNA拷贝量和HBeAg含量明显降低(P<0.05),细胞内HBV mRNA也显著减少。结论:人工设计的ZFP可以在真核细胞内正常表达,并能有效抑制HBV的转录。

摘要：目的研究灵猫方对饥饿诱导hepg2.2.15细胞自噬的作用。方法选取15只SD大鼠制备灵猫方药物血清,设立厄尔平衡盐缓冲液(Earle's balanced salt solution,EBSS)组、EBSS+空白血清组、EBSS+5倍药物血清组、EBSS+10倍药物血清组及DMEM组,每组3个样本。培养hepg2.2.15细胞1、2、4及6h,构建pEGFP-N1-LC3B表达载体,转染hepg2.2.15细胞,在荧光显微镜下观察细胞浆中GFP-LC3B分布表达变化,计算点状样GFP-LC3B的细胞数与GFP-LC3B转染hepg2.2.15细胞数比值。透射电镜观察各组hepg2.2.15细胞浆内自噬体。Western Blot检测各组hepg2.2.15细胞LC3BⅡ/Ⅰ比值(microtubule-associ-ated protein 1 light chain 3 betaⅡ/Ⅰ)。结果培养2h时,与EBSS+空白血清组比较,EBSS+5倍药物血清、EBSS+10倍药物血清明显抑制GFP-LC3B由散在分布向点状分布改变(P<0.01),电子透射电镜显示EBSS+5倍药物血清组、EBSS+10倍药物血清组抑制自噬体形成,Western Blot检测显示EBSS+10倍药物血清组LC3BⅡ/Ⅰ比值较EBSS+空白血清组明显下降(P<0.01)。结论灵猫方药物血清抑制饥饿诱导hepg2.2.15的自噬。

摘要：目的构建人NIRF基因真核表达质粒,并在hepg2.2.15细胞中表达NIRF蛋白。方法从HeLa细胞中提取总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增NIRF基因编码区全长序列,插入到pIRES2-EGFP真核表达载体中,构建重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-NIRF,转染hepg2.2.15细胞,检测细胞中NIRF基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平。结果重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-NIRF经双酶切及测序鉴定证明构建正确,转染hepg2.2.15细胞后,可检测到细胞中NIRF基因mRNA的转录及蛋白的表达。结论已成功构建了人NIRF基因真核表达质粒,并在hepg2.2.15细胞中表达了NIRF蛋白,为下一步研究其在肿瘤组织中的功能奠定了基础。

摘要：目的:应用反义锁核酸与拉米夫定作用hepg2.2.15细胞,对他们抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)效果进行比较.方法:设计针对HBV翻译起始区S基因mRNA的反义寡核苷酸,并进行锁核酸修饰,以阳离子脂质体介导反义锁核酸转染hepg2.2.15细胞;拉米夫定组直接作用hepg2.2.15细胞;分别于用药后第2、4、6、8、10天收集细胞培养上清液.用ELISA法和FQ-PCR法检测收集上清液HBsAg、HBeAg和HBVDNA的含量.MTT法分别检测反义锁核酸与拉米夫定对细胞存活率的影响.结果:拉米夫定对HBVDNA具有明显抑制作用,最高可达46.52%,但对HBsAg、HBeAg影响较小;反义锁核酸对HBsAg、HBeAg及HBVDNA均有较强抑制作用,对HBsAg、HBeAg和HBVDNA的最高抑制率分别达67.69%、59.71%和62.96%(P<0.05),且抑制随时间呈增高趋势.反义锁核酸与拉米夫定对细胞代谢均无明显影响.结论:反义锁核酸抗HBV作用机制与拉米夫定不同,反义锁核酸抗HBV作用明显优于拉米夫定.

摘要：目的利用慢病毒载体和RNAi干扰技术沉默稳定转染了HBV全基因组的肝癌细胞hepg2.2.15的BUBR1基因,并检测沉默后对细胞增殖的影响。方法设计BUBR1基因的小干扰RNA,构建稳定遗传的慢病毒载体质粒,并进行测序鉴定。测序正确后用293T细胞进行包装并获得具有高感染性的BUBR1 shRNA重组慢病毒,用重组慢病毒感染hepg2.2.15细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况;Real-time PCR检测沉默效果;MTT法检测沉默BUBR1后对hepg2.2.15细胞增殖的影响。结果测序结果证明干扰载体中的特异性干扰序列完全正确,测序鉴定正确的BUBR1 shRNA重组慢病毒转染293T细胞48 h,荧光显微镜下可见绿色荧光,病毒滴度约为10-9 TU/mL;制备成功的重组慢病毒BUBR1 shRNA以MOI=10感染hepg2.2.15细胞,72 h后转染率均达80%以上,用嘌呤霉素筛选得到稳转细胞株;Real-time PCR检测显示3对shRNA靶点转染hepg2.2.15细胞后,均显著下调BUBR1 mRNA的转录水平;MTT结果显示沉默BUBR1对hepg2.2.15细胞增殖没有明显影响。结论成功构建BUBR1基因慢病毒干扰载体,该病毒载体能有效沉默hepg2.2.15细胞的BUBR1基因,沉默后不影响hepg2.2.15细胞的增殖。

摘要：目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)preS1、preS2 DNA同聚嘌呤区设计的锁核酸在体外对HBV复制和表达的抑制作用。方法设计并合成锁核酸,以Lipo3000作为载体转染至锁核酸-脂质体组,设空白对照组,运用荧光定量PCR、化学发光免疫分析等技术观察锁核酸对HBsAg表达、HBV DNA复制的抑制作用,采用CCK8比色法观察锁核酸对hepg2.2.15细胞基本代谢的影响。结果加入锁核酸后,HBsAg、HBV DNA表达量相对于空白对照组逐渐降低,并随时间呈递增趋势,其中,preS1的3023-3037nt位点在第9天对HBsAg表达的抑制率达(61.94±4.11)%,对HBV DNA复制的抑制率达(56.08±3.22)%;preS2的3305-3320nt位点在第9天对HBsAg表达的抑制率达(72.93±4.14)%,对HBV-DNA复制的抑制率达(61.79±3.40)%。结论HBV preS1编码链的3023-3037nt位点和preS2编码链的3305-3320nt位点的反基因锁核酸片段对HBsAg表达和HBV-DNA复制的抑制效果最为明显,两者均可以作为抗HBV治疗的有效靶位。

摘要：目的构建ADH1B慢病毒表达载体并建立ADH1B稳定过表达的人肝癌细胞株hepg2.2.15。方法根据ADH1B基因序列设计引物,PCR扩增并连接于GV492载体质粒交换转化DH5α感受态,选取阳性克隆转化子进行测序鉴定。采用三质粒系统包装ADH1B慢病毒载体转染293T细胞收集上清,测定滴度。感染人肝癌细胞hepg2.2.15,嘌呤霉素筛选得到过表达ADH1B的稳定细胞株,设立空白组、阴性对照组和过表达组,通过荧光显微镜观察各组GFP表达情况,并用Western blot及RT-qPCR从蛋白、mRNA水平对ADH1B基因表达进行检测。结果通过PCR、酶切鉴定及基因测序成功构建ADH1B过表达慢病毒载体,检测病毒滴度为2×109TU·mL-1。利用此病毒悬液感染hepg2.2.15细胞,成功筛选到ADH1B稳定表达的hepg2.2.15细胞株。Western blot及RT-qPCR结果显示:重组慢病毒载体LV-ADH1B能够有效感染hepg2.2.15细胞,与空白组和阴性对照组细胞相比,在过表达组细胞ADH1B m RNA和蛋白中表达量均升高。结论成功构建ADH1B基因的重组慢病毒载体LV-ADH1B,并筛选出稳定过表达ADH1B基因的人肝癌细胞株hepg2.2.15。

摘要：目的观察siRNA对HBV基因表达和复制的抑制情况。方法针对HBVX区设计并化学合成4条siRNAs,观察在不同浓度下对hepg2.2.15细胞HBV复制的抑制作用。结果 siRNA在30nmoL/L浓度时,4种siRNA对hepg2.2.15细胞HbsAg和HBeAg无明显的抑制作用(P>0.05);在60nmoL/L和90nmoL/L浓度下,siR-NA-1和siRNA-4有明显的抑制作用(P<0.05),他们对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为41%和43%;siRNA能降低hepg2.2.15细胞HBVDNA的拷贝数。结论化学合成的siRNAs可以有效地抑制HBV基因的表达和复制。

摘要：目的观察针对乙型肝炎病毒(HBV)X区设计的siRNA表达载体pGenesil-HBVX对hepg2.2.15细胞相应蛋白表达的影响。方法筛选出最佳转染效率的剂量配比,将阳离子脂质体METAFECTENE与pGen-esil-HBVX的复合物转染hepg2.2.15细胞,于转染后24、48、72h采用时间分辨荧光免疫测定技术(TRFIA)检测上清液中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)。结果具有最佳转染效率而且不显著影响细胞活性的剂量配比为8μl∶2.5μg。pGenesil-HBVX转染hepg2.2.15细胞后24h,细胞上清液中HBsAg、HBeAg含量尚无显著变化(P>0.05);48h后HBsAg、HBeAg表达均有明显下降(P<0.01),并且持续至72h。结论pGenesil-HBVX可以在获得一定转染效率的基础上有效抑制hepg2.2.15细胞中HBV的表达。

摘要：目的使用preS1-tp融合蛋白作为新型的载体,介导针对乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白羧基端核定位信号(NLS)区的小干扰RNA(siRNA)进入感染HBV的肝细胞,从而抑制HBV复制和共价闭合环状DNA的形成。方法以慢病毒感染系统为基础,建立表达人牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽的hepg2.2.15细胞;针对HBV NLS区设计合成siRNA;表达纯化preS1-tp融合蛋白,检测其进入细胞和与DNA结合的能力;以preS1-tp融合蛋白为载体,介导NLS siRNA递送至hepg2.2.15-牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽细胞中,观察其对HBV复制和共价闭合环状DNA水平的影响。多组间比较采用方差分析,计量资料用t检验分析组间差异。结果成功构建hepg2.2.15-牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽细胞株并合成筛选出显著抑制HBV复制的HBV NLS siRNA。纯化并大量表达preS1-tp融合蛋白,以该融合蛋白为载体靶向输送HBV NLS siRNA,结果显示,融合蛋白可以有效靶向输送siRNA至hepg2.2.15-牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽细胞,不仅可有效抑制细胞中HBV mRNA,HBsAg和HBeAg表达,还能显著降低HBV DNA和共价闭合环状DNA的水平。结论preS1-tp融合蛋白利用preS1与肝细胞HBV受体结合,tp与核酸结合的双功能特点,将针对HBV NLS的siRNA靶向至感染HBV的靶细胞,靶向阻断rcDNA转运入细胞核,使siRNA发挥抑制HBV复制和共价闭合环状DNA合成的作用,为HBV感染所致慢性乙型肝炎治疗提供新策略,为彻底清除体内HBV提供新的研究视角。