摘要：热休克蛋白70 (heat shock protein 70,hsp70)是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Movi)的重要膜蛋白,是机体内高度保守的生物分子,但在种间差异大,可作为分子生物学检测的候选靶区。为建立基于hsp70基因的Movi通用型TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,并进一步了解其遗传变异情况,本研究基于GenBank中Movi的hsp70基因特征,设计特异性的引物及探针,建立了基于hsp70基因的绵羊肺炎支原体qPCR检测方法。应用建立的检测方法对88份山羊鼻拭子样品及43份疑似羊支原体性肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats, MPSG)病料进行检测。将检测结果为Movi阳性的肺组织样品进行分离鉴定,并对分离株hsp70基因进行序列分析。结果显示,建立的qPCR检测方法其相关系数为1.00,扩增效率为96.0%,斜率为-3.411,Y轴截距为37.29。特异性强,与丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides ***, Mmc)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum ***, Mccp)、莱氏无胆甾原体(Acholeplasmalaidlawii, AL)、无乳支原体(Mycoplasma agalactiae, Maga)、伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis, CP)、羊口疮病毒(orf virus, ORFV)、牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)等牛羊常见病原均无交叉反应;敏感性高,最低检测限为5.72 copies·μL^(-1);重复性优,组内变异系数和组间变异系数均小于1.00%。6株Movi分离株hsp70基因全长均为1 818 bp,与其它Movi参考株核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.4%和98.0%~100.0%;进一步分析发现,山羊源Movi均比绵羊源多1个N-糖基化位点。遗传演化分析表明,其均处于ClusterⅠA亚分支(均为山羊源)。综上,本研究建立了特异性强、敏感性高、重复性优的基于hsp70基因的Movi的qPCR检测方法。序列分析发现,不同来源Movi的hsp70基因核苷酸同源性高;遗传演化分析证实,Movi福建株与山羊源分离株遗传关系较近。本研究不仅为Movi临床诊断提供了技术支持,更为进一步了解Movi遗传演化规律提供参考。

摘要：为了获得三色堇耐热性相关的基因hsp70基因,根据GenBank上登录的拟南芥、陆地棉等hsp70基因序列设计引物,用同源克隆法分离出大花三色堇HAR的hsp70基因片段,并进行测序与比对。结果表明:克隆得到基因片段,长度为882 bp,其序列与已公布的几种植物hsp70的编码区相似率平均为85.1%,上游引物含于基因片段中。初步证明此基因片段为三色堇hsp70基因片段。

摘要：根据不同植物热激蛋白基因(hsp70)序列的保守区设计引物,利用cDNA末端快速扩增技术(RACE),从牡丹叶片中获得了热激蛋白基因的全长cDNA,命名为Pshsp70,登录号为JN639533。该基因全长2 259bp,开放阅读框长度为1 953bp,编码含650个氨基酸的稳定蛋白,蛋白分子质量为71.25ku。Pshsp70基因所编码的蛋白质有1个典型的70ku热激蛋白的保守结构域,是一种可溶性蛋白。无规则卷曲是Pshsp70基因蛋白最大的二级结构元件,而α-螺旋和延伸链则散布于整个蛋白质中。Pshsp70与芍药科同属植物芍药相似性达99%,与笋瓜等其他植物的相似性均在93%以上,由此推测该基因属于牡丹热激蛋白基因。

摘要：用PCR-SSCP和测序技术研究了541头中国荷斯坦奶牛热休克蛋白70(hsp70)基因的3'-非翻译区的多态性,并研究了多态性对奶牛产奶性状和耐热性状的影响。设计引物扩增片段大小549 bp,通过PCR-SSCP技术发现参与试验的奶牛出现了3个复等位基因:A、B和C,6种基因型:AA、AB、AC、BB、BC和CC基因型。测序发现复等位基因是由3个新的突变引起的,第6 400、6 600和6 601位碱基分别发生了G/C、C/T和G/A突变。χ2适合性检验表明,该群体在这三个位点的突变没有达到Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.01)。中国荷斯坦牛BB基因型个体红细胞钾含量和产奶量下降率显著低于其他基因型个体(P<0.05),表明BB型的中国荷斯坦牛耐热性能优于其他类型。BB基因型个体305 d产奶量高于其他5种基因型的个体,进一步说明BB基因型可能在选育高产抗热应激奶牛中得到应用。

摘要：根据GenBank中已发表的布氏旋毛虫hsp70基因序列设计了1对引物，用Trizol法从本地毛形线虫肌幼虫虫体中提取总RNA，用RT-PCR方法扩增了hsp70基因，将目的基因克隆至pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α。重组质粒用PCR、限制性内切酶BarnHⅠ和HindⅢ进行单、双酶切鉴定。测序结果表明，成功克隆了本地毛形线虫hsp70基因。序列分析表明，hsp70基因比较保守，不同物种之间氨基酸的同源性在40％～80％。与布氏旋毛虫hsp70序列相比，CDS区多出9个碱基，但核苷酸序列和氨基酸同源性分别为98%和94％，存在1个糖基化位点和1个潜在的信号肽位点。

摘要：设计引物PCR方法克隆了奶牛1926bp的hsp70基因,连接到pGEMR○-T Easy Vector上测序,与NCBI上的序列比对,发现开放阅读框内的点突变(941位点,T→C),致使314位L(亮氨酸)→P(脯氨酸)。DNAstar Protean分析点突变对蛋白的原核表达一、二级结构、等电点进行了分析,结果显示螺旋转角区数目增多,不规则卷曲发生轻微变化,但其它指标均不变。此外,通过DNAstar MegAlign用Clustal V方法分析hsp70家族蛋白的同源性、氨基酸残基替换频率并构建了分子进化树,结果发现碱性、酸性氨基酸(R和K)、分支的氨基酸(V和L)、极性氨基酸(S和T)等在生物hsp70分子进化中氨基酸发生替换的频率最高,hsp70可以作为研究生物系统演化的一个重要的工具。在上述基础上,在hsp70基因上、下游引物分别加上EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,构建了pET-32a-c(+)-bhsp70原核表达质粒,IPTG诱导成功得到重组牛源hsp70蛋白,293细胞和Hela细胞的体外实验表明原核表达的蛋白有抗凋亡生物活性[动物学报51(6)1080-1090,2005]。

摘要：利用PCR-SSCP技术对吉富罗非鱼hsp70基因多态性进行检测,并采用最小二乘法分析多态性与罗非鱼Oreochromis niloticus耐寒性状的相关性。结果发现,依据hsp70基因序列设计的引物HP70-1、HP70-4、HP70-6不同耐寒能力样本中的电泳图具有带型多态性,且该基因多态性与其耐寒性状显著相关。据此推断hsp70基因是潜在的罗非鱼耐寒相关基因。

摘要：为了进一步阐明水牛hsp70基因在热应激中发挥的作用,研究水牛hsp70基因的多态性,试验以广西沼泽型水牛血样为材料,根据hsp70基因的保守区设计引物,应用RT-PCR方法扩增获得了长度为322 bp的hsp70基因片段,并与GenBank公布的其他hsp70蛋白序列比对同时运用DNAStar分析软件构建hsp70基因的系统发育树。结果表明:克隆得到的hsp70基因片段与牛的hspA1A蛋白、野牦牛的hspA70-2蛋白和牛的hsp70a蛋白的同源性分别为98%、95%和92%;广西沼泽型水牛与杂交型水牛聚集成一支,这与牛科动物的实际进化关系吻合。

摘要：　目的:为获得凡纳滨对虾的热休克蛋白70(hsp70)基因并分析其基因序列.方法:根据GenBank中斑节对虾(Penaeusmonodon)hsp70基因的cDNA序列,设计引物,对经高盐法提取的凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)基因组DNA,采用优化的降落PCR(TouchDownPCR)程序,扩增凡纳滨对虾hsp70基因的全长序列.结果:PCR扩增得到一条长1983bp的目的DNA片段,回收纯化该片段并测定其核酸序列.用DNAman软件分析发现,该核酸序列中不含内含子,编码区全长为1959bp;经BLASTn和BLASTx软件分析发现,该编码区核苷酸序列与斑节对虾、罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)的hsp70基因序列的相似性分别为97%和62 2%.根据核苷酸序列所推导出的hsp70氨基酸序列,其与斑节对虾、罗氏沼虾的相似性分别为99 9%和92 6%.结论:成功地从凡纳滨对虾基因组DNA中直接扩增出hsp70基因的全长编码区序列.

摘要：根据GenBank登录的MO hsp70基因序列,设计特异性引物对MO新疆分离株hsp70基因进行扩增,克隆入T载体中测序。将hsp70基因亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达载体pGEX4T-1-hsp70,并转化入大肠埃希氏菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白分子质量为53ku;Western blot分析表明该重组蛋白可与MO阳性血清发生特异性免疫学反应,证实表达的重组hsp70具有良好的反应原性。重组hsp70蛋白免疫小鼠后可诱导机体产生特异性抗体,证实该重组蛋白具有良好的免疫原性。