摘要：【目的】建立一种检测鸭ifn-βmRNA转录水平的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法。【方法】根据GenBank中鸭ifn-β(KT428159)核苷酸序列设计并合成特异性引物,将鸭ifn-β基因克隆至pET-30a载体,以此构建的pET-30a-ifn-β阳性重组质粒作为阳性标准品,采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测,构建标准曲线,并进行引物特异性、灵敏度及重复性试验。【结果】该扩增特异性强,无引物二聚体及非特异性产物,熔解曲线单峰(Tm=87.94±0.16℃);Ct值在8.9-34.0线性拟合程度高,相关系数R^(2)>99.5%;灵敏度高,最低检测限为2.84 copies·μL^(-1);重复性好,对来自临床的3种组织样品检测的组内变异系数小于0.13%,组间变异系数不超过1%。【结论】该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为鸭ifn-βmRNA表达水平的定量分析提供了技术手段。

摘要：为了研究猪瘟病毒(CSFV)对ifn-β产生的影响,我们利用荧光素酶报告基因系统测定了CSFV Shimen株感染猪肾细胞PK15后人源ifn-β启动子的诱导情况,以及以新城疫病毒(NDV)作为诱导剂建立了细胞内ifn-β诱导的模型,基于该模型,我们探讨了CSFV对病毒活化的ifn-β启动子的影响。研究表明,不管条件如何改变,CSFV Shimen株都不能诱导活化ifn-β启动子。NDV可以有效诱导激活ifn-β启动子,且能与CSFV共感染同一个PK15细胞。深入研究发现,CSFV Shimen株能很好地抑制NDV对ifn-β启动子的活化,尤其是CSFV先于NDV感染或两病毒同时感染PK15细胞时,抑制效果最为明显。CSFV的这种抑制ifn-β启动子激活的特性在一定程度上解释了猪瘟病毒持续感染的机理,为抗病毒药物的设计和新药的开发以及病毒病的治疗提供了一定的借鉴。

摘要：为检测鸡抗病毒相关基因在病毒感染过程中的动态变化规律,研究建立了鸡ifn-a、ifn-β、TLR-3和TLR-7的实时荧光定量RT-PCR的检测方法。根据GenBank提供的鸡ifn-α、ifn-β、FLR-3和TLR-7参考序列设计了相应的特异引物,用常规RT-PCR方法从鸡脾脏总RNA中扩增得到鸡相应基因。将其cDNA分别克隆到pMD19-T载体中进行测序鉴定,采用SYBR Green I染料法,建立标准曲线并分析其溶解曲线。结果表明,这4种基因的检测灵敏度可高达46 copies/μL,且具有良好的特异性和重复性。此检测方法的建立为动态定量检测及研究鸡ifn-α、ifn-β、TLR-3和TLR-7基因的表达变化提供了有效的手段。

摘要：建立一种检测牛ifn-α、ifn-β基因SYBY GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,旨在为抗病毒相关研究奠定基础。设计合成扩增牛ifn-α、ifn-β基因的特异性引物,采用RT-PCR从牛脾脏中扩增出目的DNA片段,将其克隆至pMD18-T载体获得牛ifn-α、ifn-β质粒标准品,以质粒标准品为模板,优化荧光定量PCR反应条件,建立牛ifn-α、ifn-β基因SYBY GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,结果表明,牛ifn-α、ifn-β标准曲线的R2分别为0.9588和0.99652,线性良好;扩增效率为0.97和0.91,效率高;熔解曲线均为单峰,特异性较高,并具有良好的重复。结果证实,本研究所建立的方法敏感性高,特异性强,重复性好。