摘要：旨在利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术制备CD13基因敲除的ipec-j2(猪空肠上皮细胞系)细胞,揭示细胞表面分化抗原13(cluster of differentiation 13,CD13)在肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用。本研究在猪CD13基因第2外显子区域设计2个向导RNA(guide RNA,gRNA),命名为g3、g5,然后分别将g3和g5克隆到pX330-GFP和pX330-RFP载体骨架上,电转染ipec-j2细胞,48 h后通过流式细胞术分选具有双荧光标记的细胞,培养并获得单克隆细胞,PCR扩增、测序,从而获得CD13基因纯合敲除的阳性细胞系。对获得的20个细胞单克隆进行PCR,并挑取部分克隆PCR产物测序,发现共有7个克隆发生了基因片段缺失,其中1个克隆为单等位基因片段缺失,3个克隆为双等位基因杂合片段缺失,3个克隆为双等位基因纯合片段敲除。本研究检测双等位基因纯合片段敲除细胞的蛋白表达水平,其结果显示,在该纯合敲除细胞中CD13蛋白几乎不表达,表明成功构建了CD13敲除的ipec-j2细胞系。本研究获得的CD13基因敲除细胞系为探究CD13在猪肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用奠定了基础。

摘要：本试验旨在研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)对热应激诱导的猪小肠上皮细胞ipec-j2抗氧化能力、内质网应激通路蛋白表达和细胞凋亡的影响。采用单因子试验设计,试验分3组,分别为对照组(CON,37℃)、热应激组(HS,43℃)和NAC加热应激组(NAC+HS,43℃)。其中NAC+HS组细胞在NAC(0.5 mmol/L)预处理12 h后,进行热应激处理4 h,测定细胞氧化损伤情况、活性氧自由基(ROS)含量、抗氧化酶的活性、线粒体膜电位变化、细胞内质网应激和凋亡相关蛋白的表达。结果表明:与CON组相比,热应激导致细胞中ROS和丙二醛(MDA)含量显著增加,铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)、锰超氧化物歧化酶(SOD2)和过氧化氢酶(CAT)的表达量提高(P<0.05);与HS组相比,添加NAC降低了氧化损伤和抗氧化酶(SOD2、CAT)的表达(P<0.05)。与CON组相比,热应激增加热休克蛋白A5(HSPA5)、磷酸化真核细胞翻译启始因子2α(p-eif2α)、转录激活因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白表达量(P<0.01);添加NAC降低HSPA5、p-eif2α、ATF4、CHOP蛋白表达量(P<0.01)。NAC预处理降低了热应激诱导的凋亡标志蛋白细胞色素C(Cytc)和活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Active-caspase3)的表达(P<0.05)。综上,添加NAC可以缓解热应激诱导的ipec-j2细胞的氧化应激和内质网应激,减少细胞凋亡。

摘要：本研究利用广泛用于肠道感染机制研究的ipec-j2细胞系探究poCRIP2在猪胃肠道炎症中的作用。在识别poCRIP2基因全长序列的基础上研究poCRIP2的有关特征,同时对其组织表达模式进行分析,并建立有效的poCRIP2三维结构模型以解释其功能,了解poCRIP2在细菌感染过程中的免疫作用及其与NF-κB通路的关系。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从猪心获得poCRIP2的全长序列;利用Primer Premier5.0和NCBI Primer BLAST程序设计了特异性引物对,采用保家基因β-肌动蛋白(β-actin)对结果进行归一化处理,测试CRIP2基因在猪体内的组织分布;采用生物信息学方法对poCRIP2的特性进行分析,构建poCRIP2蛋白模型;利用ROBETTA服务器,以高度同源的小鼠LIM-homeodomain protein islet 1(Isl1)(PDB:4 jCj)为模板,模拟poCRIP2的三维结构;用PROCHECK和ProSA对模型进行了分析;应用Procheck对蛋白质折叠进行立体化学和拓扑分析,并应用ProSA对蛋白质折叠进行评价;使用PyMOL程序对建模结果进行评估,分析poCRIP2的保守结构域;设计肠道感染试验,分析poCRIP2在肠道免疫中的功能。结果表明,从猪心获得的poCRIP2 cDNA全长序列为1118 bp,poCRIP2蛋白与人和小鼠的同源性分别为94.23%和93.75%,它还含有两个保守区(LIM-TLP和LIM-CRP)。poCRIP2的组织表达模式分析表明,poCRIP2在所有组织中均有表达,其中在小肠、肺、胃、脾和肌肉等中表达较低。poCRIP2在革兰阴性菌作用下的表达水平比对照组高1~2倍,但NF-κB通路在同一作用下被激活,无抑制作用,poCRIP2可能不与NF-κB通路相互作用,而与其它通路共同作用于肠道免疫。本研究成功获得了猪CRIP2基因的全长序列,poCRIP2的组织表达模式表明,poCRIP2与人CRIP2相似,建立了可靠的三维结构模型,基于该模型推测poCRIP2中包含的功能主要由β折叠和α-螺旋结构实现,革兰阴性菌感染肠道后poCRIP2能被显著上调,poCRIP2应不依赖于NF-κB通路,在肠道免疫中起其他作用。