摘要：目的研究胃癌组织中野生型和突变型DNA聚合酶β在DNA修复过程中的作用,为进一步探讨肿瘤的病因发病学奠定基础。方法采用聚合酶链反应(PCR)和分子克隆技术,以野生型和突变型DNA聚合酶β基因为模板,扩增后构建pGEM-T-polβ克隆载体,经PCR筛选,亚克隆于pET28a(+)表达载体中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细菌,经诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(iptg)诱导表达后,通过镍柱亲和层析法纯化蛋白。设计3条单链DNA引物,退火合成含有单碱基缺失的DNA底物,与纯化蛋白共做碱基切除修复(BER)实验,最后琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果成功构建了pET28a(+-)polβ重组表达载体;在BER实验中,野生型DNA聚合酶β能够在DNA底物的酶切位点处将其切开,突变型DNA聚合酶β不能或部分将其切开。结论野生型DNA聚合酶β能够修复单碱基缺失的DNA底物,而突变型DNA聚合酶β在碱基缺失修复过程中的作用丧失或减弱。

摘要：生物素羧基载体蛋白(biotin carboxyl carrier protein,BCCP)负责将羧基从生物素羧化酶转移到羧基转移酶上,对于长链脂肪酸的从头合成与种子含油量的形成具有十分重要的作用。以大肠杆菌*** DH5α的DNA为模板,根据大肠杆菌基因组的Genbank中的核苷酸序列,设计2条特异引物进行扩增,克隆了大肠杆菌乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl CoA Carboxylase,ACCase)的生物素羧基载体蛋白亚基基因accB,构建accB的原核表达载体pGEX-4T-accB,转化大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株,iptg诱导进行融合表达,成功诱导表达了GST-accB融合蛋白,大小为43 kDa,该基因的原核表达为蛋白的纯化和进一步研究其功能及应用打下了良好的基础。

摘要：试验旨在探究视黄酸介导的Stra8信号在生殖细胞发生过程中的作用和调控机制。以如皋黄鸡睾丸cDNA为模板扩增Stra8基因CDS区,并与pET-28a载体相连获得原核重组表达载体pET-28a-Stra8,然后转染大肠杆菌BL21感受态,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(iptg)诱导外源基因表达,离心收集菌液,并用超声波破碎等方法收集表达的蛋白,用纯化的蛋白作为抗原制备兔源抗体,产生带有免疫抗体的兔血;取全血,经血凝离心等步骤后获取血清,通过SDS-PAGE检测抗体的纯度,将获得的含有多克隆抗体的血清进行ELISA检测效价。结果显示:成功构建pET-28a-Stra8重组载体,iptg诱导后在大肠杆菌BL21中表达,表达产物经SDS-PAGE分析后显示,STRA8蛋白大小约为55 ku;ELISA检测显示在血清稀释比为1∶256000时P/N=3.3>2.1,达到阳性血清合格标准;Western blotting结果显示制备的多克隆抗体血清可结合STRA8蛋白,该结果为进一步研究Stra8在生殖细胞发生过程中的作用和调控机制提供了基础。