摘要：目的建立一种将DNA提取技术与PCR技术相结合的天麻DNA真伪鉴定试剂盒,并对试剂盒性能进行方法学评价。方法通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)查找天麻及其常见伪品紫茉莉根、大丽菊块茎、马铃薯的its2序列,应用DNAMAN进行多序列比对,NCBI-Primer-Blast设计天麻特异性引物。改良植物常用DNA提取的CTAB法,确保提取出高效的正品天麻及其常见伪品的基因组DNA,应用紫外分光光度法测其浓度及纯度。优化PCR反应体系,确定试剂盒的组成与反应条件,随机抽样检测市售天麻样品。结果应用所研制的试剂盒提取样品DNA,纯度OD260/OD280值为(1.87±0.13),灵敏度为10 ng·μL^(-1),3次重复性检测结果相同,反复冻融5、10、15、20次对检测效果无影响,于-20℃可保存1年,检测10个市售天麻样品,其中7个是正品,3个是伪品。结论道地药材天麻DNA真伪鉴定试剂盒特异性强,灵敏度高,重复性和稳定性均良好,检测结果准确,适用于天麻及其常见伪品的快速鉴别。

摘要：宽叶山蒿为艾的近源种,两者饮片或叶绒混在一起很难鉴别。该研究旨在从分子层面建立一种快速鉴别宽叶山蒿与艾的方法。根据宽叶山蒿与艾的its2基因测序结果,使用DNAMAN软件进行序列比对,分析得到在its2基因202位存在C/T单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism,SNP);并依据此SNP位点设计特异性引物,建立并优化特异性PCR方法,以此方法进行混样检测验证可行性与稳定性。在特异性PCR条件下,使用特异性引物JNC-F与通用引物its3R,艾可以扩增出1条218 bp的特异条带,而宽叶山蒿不能扩增;使用特异性引物KY-F与通用引物its3R,宽叶山蒿可以扩增出218 bp特异条带,而艾不能扩增。建立的方法同时可以用于检测饮片及加工品叶绒,使用JNC-F/its3R体系可以检测宽叶山蒿中是否混有艾,艾饮片及叶绒的最低检测限均为3%;使用KY-F/its3R体系可以检测艾中是否混有宽叶山蒿,宽叶山蒿饮片及叶绒的最低检测限均为5%。模板检出限考察中2个体系对模板的检出限均为5 ng。构建方法可为两者质量控制提供依据,准确检测和判定市场上2种药材是否混用。

摘要：目的 针对南、北板蓝根在市场流通和中医临床用药中混用现象,建立多重连接探针扩增结合熔解曲线法来快速准确地鉴别两者。方法 针对南、北板蓝根its2序列设计两对特异性探针,通过DNA变性、杂交、连接、扩增和进行熔解程序建立MLPA-熔解曲线,根据T_(m)值的差异进行鉴别,并对其探针特异性和检测灵敏度进行考察。结果 在特异性试验中,南板蓝根产生84.98℃的熔解曲线峰,北板蓝根产生83.35℃的熔解曲线峰;在灵敏度试验中,南板蓝根中掺杂10%的北板蓝根或北板蓝根中掺杂5%的南板蓝根均可被检出。26批商品药材中,有12批熔解曲线峰与北板蓝根相符,14批熔解曲线峰与南板蓝根吻合,与测序结果一致。结论 该方法灵敏准确,特异性强,可为南、北板蓝根的鉴别提供支持。

摘要：为建立白及药材的分子标记鉴定方法,该文提取白及及其混伪品药材的基因组DNA,利用PCR技术扩增r DNA its2片段,片段经双向测序、排序、比对,构建邻接树,查找SNP位点。结果显示,its2序列不仅能够有效地区分白及与其混伪品,而且存在可用作白及、黄花白及与其混伪药材鉴别的SNP位点。针对标记白及药材的SNP位点设计引物,通过筛选引物和优化特异性扩增条件后,获取引物BJ59-412F,BJ59-412R,HHBJ-225R在同一扩增条件下,可有效扩增白及、黄花白及,其产物长度分别约为350,520 bp,而混伪品则无PCR条带产生。该文所述引物和建立的反应条件可成功将白及、黄花白及与其混伪品药材进行同步鉴定,操作快速、简捷,结果可靠,可作为白及药材的快速分子鉴定方法。

摘要：目的:采用高分辨率熔解曲线技术(HRM)快速鉴别酸枣仁与相关混伪品药材理枣仁及理枣仁杂合品种。方法:采集了14份酸枣仁及10份市售混伪品理枣仁进行样品DNA提取,通过its2序列使用NCBI的Primer-Blast设计引物,筛选引物浓度并对采集的样品进行检测分析。结果:在引物浓度为10μmol·L-1的条件下,向反应体系加入0.3μL引物时,可获得优质的熔解曲线。应用该方法对14批酸枣仁及10批理枣仁均可进行HRM曲线分析鉴别,并且通过该方法能够准确区分理枣仁及理枣仁杂合品种;将理枣仁与理枣仁杂合品粉分别掺入酸枣仁样品中,HRM检测技术最低掺伪检测限为10%。结论:基于HRM技术可实现酸枣仁与其常见混伪品理枣仁、理枣仁杂合品种的准确鉴别,对市场药材的快速检测及质量评估有一定应用前景。

摘要：目的:鉴定民族药四数九里香药材。方法:采用“传统+分子生物学”联用技术:即在传统鉴定评价的基础之上,再采用DNA试剂盒提取样本DNA,结合九里香属植物its2基因序列设计引物,对样本进行PCR扩增,对所得产物进行双向测序,测序结果与GenBank中的九里香属植物its2基因序列进行比对,采用Mega 6.0软件计算序列间的遗传距离K2P,采用邻接法构建系统进化树,进一步对样本进行鉴别。结果:检测样本与九里香属植物K2P遗传距离介于0.017~0.048之间,其中与四数九里香(Murraya tetramera)K2P遗传距离最小为0.017,采用邻接法构建的系统树显示九里香属植物具有较好的单系性,均分别独立聚为1个分支,可以显著区分九里香属植物,检测样本与四数九里香(Murraya tetramera)聚为一支。结论:its2基因序列分析结果与传统评价结果相互佐证鉴定四数九里香,将为云南华宁产四数九里香的分类学研究提供科学线索。

摘要：本研究测定了米尔顿姬小蜂Anselmella miltoni Girault的rDNA its1和its2序列,以探讨其分子鉴定方法。米尔顿姬小蜂的its1和its2侧翼区(18S和5.8S)序列相对稳定,its1和its2序列存在种间差异。根据18S rDNA部分序列,利用DNAMAN的Maximum Likelihood方法构建了与膜翅目其它科的系统发育树。根据米尔顿姬小蜂its1和its2序列设计了特异性引物,应用特异性引物对样品进行了PCR扩增,扩增效果理想,采用上述特异性引物可从单头米尔顿姬小蜂稳定地扩增出明显的目的DNA条带。因此,可以采用its1和its2区的特异性对米尔顿姬小蜂进行快速的分子鉴定。

摘要：本研究测定了褐飞虱Nilaparvata lugens、白背飞虱Sogatella furcifera和灰飞虱Laodelphaxstriatellus的rDNA its1和its2的序列,以探讨这3种稻飞虱的分子鉴定方法。3种飞虱的its1和its2侧翼区(18S,5.8S和28S)序列相对稳定,但its1和its2序列在3种飞虱中变异较大。its1在所分析的438个位点中可变位点达294个,its2在分析的403个位点中可变位点为177个。根据3种飞虱rDNA的its1和its2序列设计了特异性引物,应用特异性引物对样品进行了PCR扩增,分析发现3种飞虱its1区的特异性引物扩增效果不理想,而its2区的特异性引物可以稳定地扩增出明显的目的DNA条带。因此,采用its2区的特异性引物可以对3种飞虱进行快速的分子鉴定。

摘要：目的应用显微鉴别和基于its2序列差异的可视化探针杂交技术鉴别阳春砂、疣果砂仁、海南假砂仁。方法采用徒手切片法对砂仁及其混淆品的种子进行制片并观察其显微生物。然后提取阳春砂、疣果砂仁、海南假砂仁的总基因组DNA,PCR扩增其its2序列,回收PCR产物并连接T载体,筛选阳性质粒并测序,根据测序所得its2序列设计阳春砂的专属荧光探针,并取探针1 ng与砂仁及其混淆品的its2 PCR扩增产物进行液相杂交。反应条件:95℃变性5 min,70℃退火30 s,在489 nm荧光下进行激发检测。结果阳春砂与其混淆品的显微结构区别主要在于色素层的层数和外胚乳细胞的形状。所设计的专属探针仅与阳春砂its2 PCR产物特异性结合,而不与其混淆品结合。亦可以通过荧光的强弱来定量鉴别中成药中砂仁的掺伪现象。结论通过显微鉴别和基于its2序列差异的可视化探针杂交技术能够很好地鉴别砂仁的真伪,且不要求中药的具体形式,方法简便快捷、成本低、技术门槛低,开拓了更加便捷、准确的砂仁药材的鉴别方法。

摘要：铁皮石斛以营养价值和保健功效备受消费者青睐,但不同品种和不同品质铁皮石斛的区分和鉴别存在困难,急需建立一种快捷、准确、高效的鉴定方法。以浙江省12个铁皮石斛和其他省的10个石斛为材料,选取DNA条形码its2,优化扩增体系,对扩增产物进行测序,经序列比对与分析,获取浙江铁皮石斛DNA条形码its2中的特异性SNP位点;针对位点设计特异性引物进行了PCR验证,同时建立了基于高分辨率熔解曲线(HRM)技术对SNP位点的快速鉴别方法。研究结果表明,DNA条形码its2能较好地区分铁皮石斛与其他石斛,而铁皮石斛的its2序列中存在SNP位点,基于SNP的快速检测实现对铁皮石斛的快速鉴别,为铁皮石斛的鉴别和质量控制提供了新的理念和技术路径。