摘要：目的在目的基因原载体（DNA 模板）与克隆载体相同的条件下，探讨了 PCR 扩增片段（含目的基因）的末端与载体间同源区段长度对 In-fusion 连接效率的影响，并建立以In-fusion 技术为基础的高通量克隆方法。方法以糖基水解酶 Lxyl-p1-2（2.4 kb）基因突变库的构建为例，设计引物使目的基因的两端分别与线性化载体末端含有15~200 bp 重叠序列，并通过易错 PCR 方法获得含目的基因的 PCR 扩增片段，运用 In-fusion 技术将 PCR 扩增片段定向克隆至表达载体 pPIC3.5K 中。结果对于长度大约为2.4 kb 的较大片段 DNA 的克隆， PCR 扩增片段的末端与载体间最适同源区段长度约为100 bp，此时连接效率最高，其阳性重组率高达90%左右，是常规酶切连接法的3倍。与后者相比，该技术将克隆周期由3~4 d 缩短为1~2 d。结论优化的同源区段长度可以显著提高 In-fusion 技术对于2.4 kb 目的基因与载体的连接效率，该方法尤其适用于定向进化过程中基因突变库的构建。

摘要：为提高水运工程复杂作业环境舰载水下声学设备的定位能力,研究了舰载POS MV系统组成单元及搭载的Applanix IN-fusion GNSS INS组合定位基本原理。基于POSPac MMS构建了4种POS数据后处理模式选择策略及方法流程,形成了舰载POS数据采集与处理核心技术体系。依托温岭航道疏浚工程扫测项目开展离岸35 km持续2.17 h的POS MV WaveMaster数据采集及处理工程实践。研究结果表明:1)POS MV在非星站差分情况下,其实时定位平面、高程精度均为米级,横纵摇、艏向平均精度分别为0.026°、0.029°。2)在POSPac MMS的PP-RTX和SingleBase后处理模式下,平面、高程定位精度提高至2~3 cm,横摇、艏向平均精度分别提高至0.012°、0.015°,真垂荡数据中误差稳定在0.01 m。3)POS MV可以实时获取稳定、有效的惯导数据,辅助后处理技术能够为水运工程提供准确的位置和姿态信息。

摘要：丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)是C4植物和景天科酸代谢(CAM)植物光合作用的关键酶,催化形成固定CO2的初始分子受体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。玉米的C4型PPDK基因序列较长,难以直接克隆。本研究设计多对引物,首先利用常规PCR扩增PPDK启动子,再利用分段PCR扩增PPDK基因全长编码序列;测序证实克隆序列正确无误,最后利用in-fusion技术将各个片段定向克隆至载体p CAMBIA-1391Z,成功构建了玉米C4型PPDK基因的植物表达载体。最终为C4型PPDK基因功能研究和C3植物遗传转化提供可用的基因序列,为全长基因的高效克隆及表达载体构建提供参考。

摘要：目的构建PHD2基因原核表达载体pET-43.1b(+)-PHD2,实现Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达。方法用SacⅠ酶切pET-43.1b(+)制备线性化载体,设计与线性化载体两端具有至少15个同源序列的特异性引物,以真核重组质粒pCMV6-Entry-EGLN1为模板,PCR法扩增PHD2目的基因。采用in-fusion技术构建原核表达载体pET-43.1b(+)-PHD2,并将其导入大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达。用SDS-PAGE和Western blot分析并鉴定表达出的融合蛋白。用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白。结果成功构建了PHD2原核表达载体;SDS-PAGE结果显示融合蛋白以可溶性形式表达;Western blot鉴定表明融合蛋白可以与PHD2单克隆抗体特异性结合。结论实现了Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达,为PHD2生物学功能的研究奠定了基础。