摘要：目的构建针对小鼠jmjd3基因的RNAi慢病毒载体,感染小鼠骨髓间充质干细胞(mouse bone marrow mesenchymal stem cells,mBM-MSCs)后观察其对jmjd3基因表达的影响及对组蛋白H3K27me3的去甲基化作用。方法根据jmjd3mRNA序列设计并合成3对shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入PLL3.7慢病毒干扰载体,双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,重组质粒与其他3种辅助包装质粒(pRsv-REV,pMDlg-pRRE,pMD2G)共转染293T细胞生产病毒液,病毒液感染mBM-MSCs,荧光定量PCR和Western blot检测目的基因jmjd3的表达,筛选出最有效的干扰序列。Western blot检测组蛋白H3K27me3的表达量,分析jmjd3的生物学功能。结果双酶切和测序结果证实jmjd3基因shRNA序列正确插入慢病毒载体。荧光定量PCR和Western blot结果显示,感染后jmjd3表达显著下调,与空载体对照组相比,jmjd3-shRNA1组、jmjd3-shRNA2组和jmjd3-shRNA3组分别下调88.9%(P<0.001)、67.9%(P<0.001)和72.4%(P<0.001),jmjd3-shRNA1组为最佳干扰组。Western blot结果显示干扰jmjd3之后,H3K27me3的表达较空载体对照组升高。结论成功构建了针对小鼠jmjd3基因的慢病毒干扰载体,并能有效抑制mBM-MSCs中jmjd3基因的表达,jmjd3具有组蛋白H3K27me3的去甲基化作用。

摘要：目的构建针对SD大鼠jmjd3基因RNAi慢病毒载体,转染大鼠骨髓间充质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)后观察其对jmjd3基因的抑制作用并筛选最有效干扰序列。方法设计4对jmjd3基因shRNA寡核苷酸序列,插入pGCSIL-GFP载体形成重组载体。重组载体经过测序鉴定后转染293T细胞生产病毒液,病毒液转染大鼠BMSCs,Western blot分析转染前后jmjd3表达情况。通过计算jmjd3灰度值/ACTIN灰度值,筛选出最有效的干扰序列。结果测序结果证实jmjd3基因shRNA寡核苷酸序列正确插入载体中,成功构建4个大鼠jmjd3基因RNAi表达载体。Western blot检测显示转染后jmjd3蛋白表达显著下调,半定量分析显示相对于未转染组,shRNA-1组、shRNA-2组、shRNA-3组、shRNA-4组分别下调79.5%(P0.05),shRNA-2组为最佳干扰序列。结论针对大鼠jmjd3基因RNAi慢病毒载体构建成功,并能有效抑制BMSCs中jmjd3基因的表达。