摘要：本研究探讨Sam68基因对人急性T淋巴细胞白血病细胞jurkat增殖的影响。针对Sam68 mRNA 531-552靶位点设计并合成shRNA,构建pLKO-Tet-On条件性真核干扰载体,制备慢病毒并感染jurkat细胞;应用强力霉素(Doxycycline)诱导干扰载体表达,用Real-time PCR和Western blot验证干扰效率,用改良MTT法检测沉默Sam68基因对jurkat细胞活力的影响,用体外细胞集落形成实验观察沉默Sam68基因对细胞集落形成能力的影响,用流式细胞术分析沉默Sam68前后细胞周期的变化。结果表明:与对照组相比,实验组Sam68基因的表达被有效抑制(P<0.05);沉默Sam68基因降低了jurkat细胞活力,抑制了细胞的集落形成能力并且导致S期细胞比例显著增加,G2期细胞比例显著降低(P<0.05)。结论:利用shRNA靶向干扰Sam68基因的表达可以有效抑制人急性T淋巴细胞白血病jurkat细胞的增殖。

摘要：背景:国内外文献表明,催乳素可通过调节细胞内凋亡相关蛋白的表达促进免疫细胞增殖并抑制细胞凋亡。目的:拟验证催乳素是否能通过调节T细胞Bax和Bcl-2的表达来影响jurkat细胞凋亡。设计、时间及地点:以细胞为对象的对比观察实验,于2006-07/2007-05在新乡医学院免疫学实验室完成。材料:人白血病T细胞株jurkat细胞为上海生工产品,人催乳素为sigma公司产品。方法:以10Gyγ-射线照射jurkat细胞建立细胞凋亡模型。在射线照射前30min内,于模型中分别加入20μg/L,300μg/L和1000μg/L的人催乳素进行干预,同时设不含人催乳素的对照组,以及不进行辐射处理且不加催乳素的正常组。于辐射后的0,24,48h收集细胞。主要观察指标:以四甲基偶氮唑盐法检测jurkat细胞的增殖情况;以流式技术检测细胞凋亡情况;以琼脂糖凝胶电泳检测jurkat细胞凋亡DNA;以WesternBlot法检测jurkat细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达水平。结果:①在γ-射线处理后24和48h,与对照组比较,300μg/L和1000μg/L催乳素组和正常组的细胞数量明显增多(P<0.01)。②在细胞经γ-射线处理后48h,与对照组比较,300μg/L和1000μg/L催乳素组和正常组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。③在γ-射线处理后的24和48h,与对照组比较,各质量浓度催乳素组Bcl-2/β-actin灰度比值均明显升高(P<0.01);300μg/L和1000μg/L催乳素组Bax/β-actin灰度比值明显降低(P<0.01)。结论:在γ-射线诱导的jurkat细胞凋亡过程中,催乳素可通过提高Bcl-2的表达并下凋Bax的表达,来抑制jurkat细胞凋亡。

摘要：牛乳铁蛋白素(Bovine Lactoferrcin,LfcinB)是一类具有广谱抗菌作用的生物活性肽,能够选择性诱导肿瘤细胞凋亡,但并没有对LfcinB诱导肿瘤细胞的凋亡特性进行分析。本实验利用荧光倒置显微镜初步检测牛乳铁蛋白素(LfcinB)影响jurkat细胞增殖的作用方式,运用Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术将LfcinB促进jurkat细胞凋亡的阶段进行区分和定量。通过实验得出结论,LfcinB是通过诱导jurkat细胞发生早期凋亡来抑制其增殖的,并且早期凋亡率与作用浓度呈正相关。这一结论为更深一步研究LfcinB对肿瘤细胞的作用机制奠定基础。

摘要：目的探讨RNA干扰技术沉默热休克蛋白90β(heat shock protein90beta,Hsp90β)基因表达对jurkat细胞生长的抑制作用。方法根据Hsp90β基因全长cDNA序列Hsp90B1(NM_003299.1),设计并构建针对Hsp90β基因的siRNA真核表达载体,应用LipofectamineTMLTX转染入jurkat细胞后,Real-time PCR检测Hsp90βmRNA水平的变化,筛选出沉默效果最好的Hsp90βsiRNA干扰片段;Western印迹法检测Hsp90β蛋白表达水平;MTT法和流式细胞仪检测干扰前后对jurkat细胞生长抑制作用。结果成功构建Hsp90β基因特异性的真核表达载体pSOS-Hsp90βi,转染jurkat细胞后发现pSOS-Hsp90βi2的沉默效果最明显,jurkat细胞Hsp90βmRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.05)。Hsp90β基因表达沉默后,jurkat细胞增殖明显受抑(P<0.01),实验组与对照组的细胞凋亡率分别为:(2.69±0.34)%、(3.63±0.38)%、(19.56±0.62)%,细胞凋亡率比空白对照组及转染pSOS-Hsp90βi control组明显增加,差异具有显著意义(P<0.05)。结论靶向Hsp90β的siRNA下调Hsp90β表达对人白血病jurkat细胞有明显的生长抑制作用。

摘要：本研究探讨C-MYCsiRNA对急性淋巴细胞白血病细胞系jurkat细胞的增殖、凋亡的影响。采取化学合成法合成针对C-MYCmRNA的第1545-1565靶位点设计的siRNA,经转染剂(HiPerFect transfection reagent)转染入jurkat细胞,观察细胞形态学变化;应用四唑氮化合物(MTS)法绘制细胞生长曲线;用细胞集落培养观察C-MYCsiRNA对jurkat细胞增殖的影响;应用流式细胞术和TdT酶介导的末端缺失原位标记(TUNEL)法分析细胞的凋亡。结果表明,不同浓度C-MYCsiRNA作用于jurkat细胞后,细胞的生长受到不同程度的抑制,抑制率随C-MYCsiRNA浓度的增高而增高。C-MYCsiRNA对集落形成也有明显的抑制作用。TUNEL法、流式细胞仪均检测出细胞凋亡,且随着作用时间的延长,其凋亡率也逐渐上升。结论:化学合成法合成的C-MYCsiRNA能明显抑制jurkat细胞的增殖与集落形成,并可诱导jurkat细胞发生凋亡。

摘要：采用流式细胞术分析了牛乳铁蛋白素(Bovine Lactoferrcin,LfcinB)对jurkat细胞增殖周期、细胞表面分化抗原表达水平的影响。结果表明:LfcinB处理jurkat细胞后,随着LfcinB浓度增加,处于G1/G0期的jurkat细胞百分率明显上升,S期的细胞百分率明显下降,细胞表面分化抗原CD11b表达水平明显升高;此外,利用CCK-8法、NBT还原反应观察LfcinB对jurkat细胞增殖、分化的影响,发现细胞增殖抑制率显著上升,NBT还原反应OD值明显提高,具有剂量和时间依赖性。以上结果说明,LfcinB能够通过细胞周期阻滞抑制jurkat细胞增殖,并能诱导其分化。

摘要：本研究构建miR-20a基因的miRNA海绵载体,建立jurkat-S稳定细胞株,为进一步研究的miR-20a功能及应用干扰技术治疗奠定基础。设计、合成1对含有2个重复针对miR-20a成熟序列第9-12碱基错配的序列,并带有酶切位点,退火后连接到pCDNA3.0-L表达载体上;载体双酶切后再与退火产物连接,重复4次后进行酶切及荧光素酶活性鉴定;亚克隆到慢病毒表达载体,与psPAX2、PMD2G共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,感染jurkat细胞,建立稳定细胞株;应用实时PCR和Western blot技术分别检测jurkat-S稳定细胞中P21及E2F1 mRNA和蛋白的表达,并与对照组进行比较。结果表明,成功构建了针对miR-20a基因的海绵载体,病毒滴度为5×107TU/ml;建立了稳定转染的jurkat-S细胞株。有效干扰验证显示,miR-20a海绵能明显上调P21及E2F1的mRNA及蛋白表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建miR-20a基因的miRNA海绵载体,建立稳定干扰miR-20a表达的jurkat-S细胞株。

摘要：本文研究探讨下调CXCR4的表达对人T-ALL jurkat细胞周期和凋亡的影响。设计合成CXCR4的特异性siRNA,采用脂质体转染jurkat细胞株。用RT-PCR检测siRNA对细胞内CXCR4基因表达的影响,用流式细胞术检测细胞周期分布和细胞的凋亡情况。结果表明:成功构建了CXCR4的特异性siRNA;与空白对照组相比,转染CXCR4 siRNA的jurkat细胞的CXCR4 mRNA表达水平明显下降(56.9%±1.4% vs 68.3%±2.4%),G0/G1期细胞比例增加(35.8%±1.9% vs 18.1%±1.2%),G2/M期和S期细胞比例相应下降(19.8%±1.7% vs 27.2%±1.5%;44.4%±2.1% vs 54.7%±2.8%),凋亡细胞率明显增高(20.9%±2.0% vs 3.13%±0.9%)。结论:CXCR4的特异性siRNA能够有效下调CXCR4基因表达,诱导jurkat细胞凋亡和细胞周期阻滞,从而抑制细胞的增殖。

摘要：目的:研究hes家族bHLH转录因子4(HES4)与急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞系jurkat对化疗药物阿糖胞苷(Ara-C)的敏感性作用。方法:构建Lenti-pCDH-HES4-puro质粒,包装慢病毒感染jurkat细胞,感染空载体Lenti-pCDH-puro为对照组,puromycin筛选阳性细胞,Realtime-PCR检测转录水平HES4过表达情况,CCK8法检测jurkat对Ara-C敏感性,Ara-C终浓度为0.1、1、10、100、1000、10000 nmol·L^(-1);设计3对针对于HES4的特异sgRNA序列,构建LentiGuide-sgRNA1-puro、LentiGuide-sgRNA2-Puro、LentiGuide-sgRNA3-puro质粒,LentiGuide-puro空载体为对照组,包装慢病毒感染jurkat细胞,puromycin筛选,提取基因组DNA,PCR扩增sgRNA的靶序列,一代测序检测HES4的敲除效率,CCK8法检测敲除HES4后jurkat对Ara-C敏感性,Ara-C终浓度为0.1、1、10、100、1000、10000 nmol·L^(-1)。结果:与对照组相比,HES4在jurkat中过表达(2.37±0.09)倍(P0.05)。结论:HES4抑制T-ALL细胞系jurkat对Ara-C的敏感性,为T-ALL化疗耐受的机制研究提供指导。

摘要：目的　获得 9 1C3胞内抗体基因的真核表达载体 ,观察胞内抗体对 9 1C3分子表达的抑制作用 ,为进一步研究 9 1C3分子对NK细胞功能的影响打下基础。方法　设计引物 ,以 9 1C3ScFv基因为模板进行PCR扩增 ,引入蛋白质内质网定位所需的信号肽、KDEL以及作为表达检测标记的E tag序列。回收纯化PCR产物 ,酶切后连接到pUC19载体上 ,并进行序列测定。序列正确后切下胞内抗体基因片段 ,重组到真核表达载体pRc/CMV中 ,酶切鉴定后用DEAE dextran方法瞬时转染真核细胞COS7,用胞内染色和Westernblot方法检测胞内抗体的表达。接着用Lipofectamine把胞内抗体基因转入 9 1C3阳性的jurkat细胞 ,用FCM观察胞内抗体对 9 1C3分子表达的影响。结果　DNA序列测定证明 ,通过PCR成功地为 9 1C3ScFv引入了内质网定位所需的信号肽、KDEL及E tag序列 ,成功地构建了胞内抗体真核表达载体 ,通过胞内染色方法和Westernblot证明胞内抗体在COS7中得到表达。转入jurkat细胞后发现胞内抗体能下调 9 1C3分子的表达水平。结论　以 9 1C3ScFv基因为模板PCR扩增得到 9 1C3胞内抗体基因 ,并构建了真核表达载体。