摘要：背景与目的:近年来兴起的DNA芯片技术能在一次杂交中同时监测数以千计的基因表达,能大大加速肿瘤药物作用机制的研究和药物治疗靶点的发现。本研究的目的是利用基因表达谱芯片研究松胞素B(cytochalasinB,CB,旧称细胞松弛素B)对白血病k562细胞基因表达谱的影响。方法:利用限制性显示RCR(restrictiondisplayPCR,RD-PCR)技术扩增k562细胞cDNA片段,取其中277个cDNA片段按设计的矩阵打印在玻片上,制成基因芯片;用CB处理k562细胞24h,分别提取对照组和处理组细胞总RNA,将两组等量的细胞总RNA纯化为mRNA,反转录为cDNA,利用RD-PCR技术进行扩增标记;与芯片杂交后扫描分析处理前后表达差异的基因。结果:在所收集的探针中,对照组和处理组细胞间存在差异表达的基因。共筛选到CB处理后表达下调的基因18条。结论:CB诱导后的k562细胞部份基因表达呈下调趋势,其中大部分基因与细胞增殖、信号转导、转录调节相关。

摘要：目的:构建成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)真核表达载体MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/purofgfr3-DN,并检测FGFR3蛋白在人白血病细胞系k562中的表达。方法:通过PCR法获得FGFR3全长基因(fgfr3-WT)和截短失活型的FGFR3(fgfr3-DN),经双酶切后与真核表达载体MSCV/puro连接,构建MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN重组表达质粒。经PCR、双酶切及测序鉴定正确后,脂质体介导转染至人白血病细胞系k562中,经puromycin抗性筛选后,Western blotting法和流式细胞术检测细胞中FGFR3蛋白的表达。结果:PCR法鉴定MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN重组质粒,2个质粒分别扩增出2 400bp的fgfr3-WT全长基因片段和1 200bp的fgfr3-DN截短型片段,表明成功扩增fgfr3-WT全长基因和1 200bp的fgfr3-DN基因;双酶切MSCV/puro-fgfr3-WT重组质粒,获得2 400bp的目的基因片段;测序显示,fgfr3-WT片段大小为2 400bp,Blast对比分析表明测序结果与GenBank中的FGFR3序列完全一致。fgfr3-DN片段大小与预先设计的序列完全一致,表明成功构建野生型FGFR3和突变失活型FGFR3真核表达载体;Western blotting检测,与对照组(k562-MSCV)比较,MSCV/puro-fgfr3-WT转染组(k562-WT)FGFR3蛋白表达水平增加,表达水平是对照组的10倍以上;MSCV/puro-fgfr3-DN转染组(k562-DN)的截短型的FGFR3(k562-DN)高表达,而对照组和k562-WT转染组则无此片段;流式细胞术检测,k562-WT组有57.5%的细胞高表达FGFR3,k562-DN组有41.5%的细胞高表达FGFR3-DN。结论:成功构建高表达野生型和突变型FGFR3的人白血病细胞系k562。

摘要：目的合成并评价磷酰胺类化合物体外对白血病细胞株 k562 生物活性的抑制作用。方法以芳氨基为药效基团,羟脯氨酸为载体设计目标物,通过几步亲核取代反应合成一系列新化合物,并表征其结构。MTT 法测定它们对人慢性髓性白血病细胞株 k562 细胞的抑制作用。结果发现了 10 个新化合物有一定的生物活性。结论发现了一类新的具有一定抗肿瘤活性的磷酰胺类先导化合物。

摘要：目的观察缄默PLk1基因的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对k562细胞内PLk1表达和细胞凋亡的影响,探讨PLk1在白血病发病中的作用,寻找更为有效的白血病治疗途径.方法设计合成针对PLk1基因1416～1436位点的shRNA片段,并将其克隆于绿色荧光蛋白的表达载体pEGFP-H1中,命名为pEGFP-H1/PLk1.通过电穿孔转染法将其导入k562细胞中,分为对照组、pEGFP-H1空载体转染组和pEGFP-H1/PLk1 shRNA重组质粒转染组,转染后24,48 h,分别通过RT-PCR和Western blot检测各组细胞PLk1基因和蛋白水平的变化,以MTT方法测各组细胞的增殖活性,比色法检测各组细胞的半胱天冬酶3(caspase-3)蛋白酶活性,并通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡和G2/M期转变情况.结果PLk1 mRNA相对水平(与内参的灰度比值):对照组为1.25±0.07,空载体转染24,48 h组分别为1.21±0.08和1.23±0.09,shRNA重组质粒转染24,48 h组分别为0.52±0.04和0.25±0.02,shRNA重组质粒转染组较其他两组明显降低(P＜0.01).各组细胞PLk1的蛋白水平变化趋势与PLk1 mRNA表达相似.相应地,对照组、空载体转染48 h组、shRNA重组质粒转染24,48 h组的凋亡率分别为(8.3±0.6)%、(8.7±0.7)%、(49.7±3.8)%和(82.3±6.9)%,后两者与前两组之间差异有统计学意义(P＜0.05).此外,与对照组和空载体转染组相比,shRNA重组质粒转染组的细胞增殖能力明显下降(P＜0.05),且位于G2/M期的细胞较对照组和空载体转染组显著增加.以上结果均于转染后48 h时较明显(P＜0.05).结论构建的shRNA能明显抑制转染细胞PLk1的表达和增殖,并可促进转染细胞的凋亡,并使停留于G2/M期的细胞显著增加.

摘要：本研究旨在检测独立生长因子(Gfi-1)在白血病患者的表达水平并探讨慢病毒介导的gfi-1基因沉默对人白血病细胞株k562增殖的影响。采用荧光实时定量PCR及Westernblot方法检测初治白血病患者gfi-1的表达水平,分析其在各型白血病中的表达情况。设计、合成一对针对gfi-1 mRNA的shRNA序列,退火后连接到pLVTHM干扰载体上,与psPAX2、PDM2G共转HEk293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,感染k562细胞,建立稳定株。应用实时定量PCR和Western blot方法检测k562细胞gfi-1及baxmRNA和蛋白的表达,并与对照组进行比较.结果表明:慢病毒介导的shgfi-1能明显降低gfi-1的mRNA及蛋白水平,而bax的mRNA及蛋白水平则都上调。CCk-8检测发现,与对照组相比,shgfi-1能明显抑制k562细胞的增殖。结论:gfi-1在初治白血病患者中的高表达可能参与白血病的发生发展。gfi-1特异的shRNA干扰可以有效地下调k562细胞gfi-1基因的表达,抑制k562细胞的增殖,gfi-1基因可能是白血病基因治疗的一个有效靶点。

摘要：本研究旨在检测白血病细胞株及其耐药株中两种药物代谢相关基因的单核苷酸多态性。培养白血病细胞株k562及其耐药株k562/A02,采用QIAamp DNA Blood Minikit试剂盒提取基因组DNA,设计引物,应用PCR技术扩增相应目的片段;采用基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术检测mthfr基因rs1801131、rs1801133、rs2274976及dpyd基因rs1801159、rs1801160、rs17376848的单核苷酸多态性。结果表明,在k562和k562/A02两种细胞中,mthfr基因rs1801131基因型均为CA、rs1801133均为CC、rs2274976均为GG;dpyd基因rs1801159基因型均为GG、rs1801160均为GG、rs17376848均为AA。结论:mthfr、dpyd基因上述位点在k562和k562/A02两种细胞中基因表达无差别。

摘要：目的探讨Apollon反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN)对白血病细胞k562增殖及凋亡的影响。方法设计合成特异性的Apollon硫代磷酸ASODN及其对照错义寡核苷酸(missenseoligonucleotide,MSODN),脂质体介导转染k562细胞后,采用MTT法检测k562细胞增殖,AnnexinV-FITC法检测细胞的凋亡。结果 Apollon反义寡核苷酸对k562细胞的生长抑制呈浓度-时间依赖性。Apollon ASODN在终浓度为600nmol/L作用k562细胞时,能明显抑制其增殖,k562细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。结论 Apollon反义寡核苷酸可下调Apollon基因表达,有效抑制k562细胞的增殖,并促进k562细胞凋亡。

摘要：目的构建高效干扰Hoxa10基因表达的shRNA真核载体,探讨其对人慢性髓系白血病细胞株k562对化疗药物柔红霉素(daunorubicin,DNR)敏感度的影响。方法设计合成针对Hoxa10的特异性shRNA寡核苷酸链,构建真核表达载体pGPHI/GFP/Neo-Hoxa10并测序,应用阳离子脂质体转染k562细胞。实验分三组:正常对照组、阴性对照组、实验组(分别为正常k562细胞、阴性对照质粒转染k562细胞、pGPHI/GFP/Neo-Hoxa10转染k562细胞),三组细胞均加入不同浓度的DNR。RT-PCR检测Hoxa10 mRNA的表达,应用MTT检测各组细胞对DNR的敏感度,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果成功构建pGPHI/GFP/Neo-Hoxa10载体并转染k562细胞,该载体能有效降低Hoxa10mRNA表达水平ODR=(38.864±4.488)%;MTT结果显示Hoxa10重组载体可显著降低k562细胞对DNR的IC50(P<0.05),对DNR的敏感度能提高约3.58倍。流式细胞术结果显示,该载体下调Hoxa10的表达后,细胞的凋亡率显著增加,可达(16.207±4.891)%(P<0.05),且联合DNR后细胞凋亡率明显提高,凋亡率达(76.887±0.967)%(P<0.05)。结论本实验构建的靶向Hoxa10的真核表达载体对k562细胞中Hoxa10的表达有明显抑制作用,并能明显增强其对DNR的化疗敏感度。

摘要：目的探讨Apollon反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASODN）对白血病细胞k562增殖、凋亡及耐药的影响。方法设计合成特异性的Apollon硫代磷酸ASODN及其对照错义寡核苷酸（***，MSODN），脂质体介导转染k．562细胞后，采用四甲基偶氮唑蓝（MTF）比色法检测k562细胞增殖，AnnexinV—FITC法检测细胞的凋亡，并用MTI＂法检测k562细胞对依托泊苷、长春新碱及联合用ASODN的耐药性。结果ApollonASODN对k562细胞的生长抑制作用随浓度和时间增加而增加。ApollonASODN在终浓度为600nmol/L作用k562细胞时，能明显抑制其增殖，k562细胞凋亡率显著增加（P〈0．01），联合用药组对细胞的半数抑制浓度低于单药组。结论ApollonASODN可下调Apollon基因表达，有效抑制k562细胞的增殖，并促进k562细胞的凋亡，ApollonASODN与依托泊苷和长春新碱联合作用可降低细胞生存率，降低细胞耐药性。

摘要：目的构建bcl-2shRNA表达载体,观察其在人白血病k562细胞系中对bcl-2基因的干扰作用。方法设计合成有短发夹结构靶位bcl-2基因的65个碱基的寡核苷酸,连接到载体pSIREN-Shuttle(pSS),构建了bcl-2shRNA表达载体,得到重组质粒pSS-shbcl-2-1、pSS-shbcl-2-2、pSS-shbcl-2-3和一个阴性对照,将其稳定转染k562细胞,分别用RT-PCR、Western-blot法检测转染后k562细胞bcl-2 mRNA及蛋白质表达水平。结果成功构建了bcl-2shRNA的表达载体,并筛选到转染后k562细胞在pSS-shbcl-2-3组bcl-2基因的mRNA和蛋白质表达水平明显抑制。结论特异性的bcl-2shRNA可以干扰k562细胞中bcl-2基因的表达,针对bcl-2基因不同位点的不同shRNA也有干扰效果的差异。