摘要：目的: 构建并表达抗人血管内皮生长因子受体kdr单链抗体(scFv)蛋白, 并测定其生物学活性。方法: 设计合成抗kdr单抗 (mAb)Ycom1D3VH、VL引物, 通过重叠延伸拼接 (splicingoverlapextensive, SOE)PCR, 在VH 和VL基因间引入柔性短肽(Gly4Ser)3, 构建抗kdrscFv基因并进行序列分析。将其克隆入pAYZH原核表达载体, 在大肠杆菌中诱导表达, 并以ELISA及免疫荧光结合实验测定重组蛋白的生物学活性。结果: 序列分析表明, 抗kdrscFv基因的全长为 729bp, 编码 243个氨基酸。将重组体表达产物进行SDS PAGE及Westernblot分析显示, 融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为 30 000, 同预期的结果一致。表达产物主要以不溶性包涵体的形式存在, 表达量占菌体总蛋白的 20%。表达产物经变性、纯化及体外复性后, 纯度达 90%以上。ELISA和竞争性免疫荧光结合实验显示, 重组小分子scFv可与可溶性kdr抗原及表达kdr受体的人脐静脉内皮细胞特异性结合, 保留了亲本mAb的抗原结合活性。结论: 成功地构建了抗kdrscFv基因, 并在大肠杆菌中功能性表达, 为靶向诊断、治疗及进一步基因工程改造奠定了基础。

摘要：目的:应用RNA干扰技术设计构建针对血管内皮细胞生长因子受体kdr的小干扰RNA,并观察脂质体转染肺癌细胞A549后的干扰效果。方法:实验于2005-03/2006-01在沈阳医学院生物化学及分子生物学教研室完成。①设计针对kdr编码区有短发夹结构的3条mRNA序列,经退火成互补双链,克隆到pGCsi.H1/neo/GFP载体中构建3个重组质粒,分别命名为kdr-siRNA1、kdr-siRNA2和kdr-siRNA3。②设立5组:小干扰RNA组,分别转染kdr-siRNA1、kdr-siRNA2和kdr-siRNA3;阳性对照组,转染pGCsi.H1/neo/siGFP,该质粒载体中的插入序列为针对绿色荧光蛋白的小干扰RNA,不干扰待研究的内源性基因;阴性对照组,转染pGCsi.H1/neo/GFP/NON,该载体为不干扰任何内源性基因的小干扰RNA;空白对照组,转染pGCsi.H1/neo/GFP空载体;正常对照组,不进行任何转染。③对重组质粒进行酶切鉴定、DNA测序分析;脂质体法转染质粒至肺癌A549细胞株后,实时定量PCR检测kdrmRNA的水平变化;细胞计数法绘制细胞生长曲线。结果:①小干扰RNA表达载体的鉴定:kdr-siRNA1、kdr-siRNA2和kdr-siRNA3表达载体用限制性内切酶NdeⅠ和SmaⅠ进行单酶切后,均产生约713bp、5480bp和2403bp、3790bp两个片段,与预期结果相同。测序结果与设计的编码相应短发夹状kdr-小干扰RNA的寡核苷酸序列一致,证明kdr-小干扰RNA真核表达载体构建成功。②kdr-小干扰RNA对A549细胞中kdrmRNA水平的影响:与阳性对照组、阴性对照组、空白对照组和正常对照组的A549细胞相比,kdr-siRNA1,2,3表达载体转染后的A549细胞kdr基因表达水平均明显受到抑制,抑制率分别为64%、81%和72%,其中以kdr-siRNA2抑制作用最为明显。③kdr-小干扰RNA对A549细胞生长的影响:阳性对照组、阴性对照组、空白对照组、正常对照组的A549细胞生长趋势较为一致,且生长速度均明显高于转染3种kdr-小干扰RNA表达载体的A549细胞,从接种第2天开始差异有显著性意义(t=15.29～17.65,P均<0.01)。结论:血管内皮细胞生长因子受体kdr靶向RNA干扰重组质粒构建成功,该载体能有效抑制肺癌A549细胞kdr基因表达与细胞增殖。

摘要：[目的]探讨kdr基因对胃癌MGC-803细胞增殖和凋亡的影响。[方法]设计及合成kdr的siRNA序列,LipofectamineTM 2000转染MGC-803细胞。通过RT-PCR、Western Blot检测kdr在干扰后的mRNA和蛋白的表达情况,利用流式细胞仪检测细胞周期,WST-1法检测细胞增殖活性,TUNEL法检测细胞凋亡情况。[结果]kdr mRNA和蛋白表达,观察组较对照组和空白组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组细胞的生长速度明显减慢,细胞周期被阻滞在G0/G1期,S期细胞数减少,差异有统计学意义(P<0.05)。转染kdrsiRNA的MGC-803细胞的增殖能力明显受到抑制(P<0.05),且明显促进了细胞的凋亡,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]特异性干扰kdr基因表达可抑制胃癌MGC-803细胞的增殖,并促进肿瘤细胞凋亡。kdr的siRNA序列可能成为治疗胃癌的有效靶点。

摘要：目的构建针对血管内皮生长因子(VEGF)受体kdr基因的siRNA慢病毒载体,鉴定其对肺癌细胞株A549基因干扰效果。方法设计合成针对kdr编码区的三条siRNA序列及阴性对照序列,克隆到PGCL-GFP载体,构建重组质粒,行PCR鉴定、DNA测序分析;转染人肺癌细胞株A549,Real-Time PCR及Western blot分别检测kdr mRNA、蛋白水平变化;细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期。结果成功构建pGCL/kdr-siRNA重组质粒。A549干扰组kdr mRNA表达率下降,kdr蛋白表达量明显减少,细胞周期改变。结论构建的pGCL/kdr-siRNA表达载体可在mRNA和蛋白水平上有效抑制A549细胞株kdr基因的表达。

摘要：微小按蚊Anophelesminimus是云南省勐腊地区的重要传疟媒介，DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂在该地区长期大量使用，研究微小按蚊与kdr抗性密切相关的para型钠通道基因对该地区选择合理的媒介控制方案预防和阻断疟疾的流行提供理依据。本文分别于2010和2011年9～10月在云南省勐腊县龙塘村和东方红村现场采集微小按蚊后，用分子学方法进行分型，根据GenBank发布的微小按蚊para钠通道IIS6段基因组DNA序列设计特异性引物，扩增现场采集的微小按蚊的该段基因，并测序对比。通过对415个个体的检测发现，1014位点编码的TTA氨基酸密码子没有突变，说明截止目前云南勐腊地区微小按蚊对DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的kdr分子机制尚未出现，其击倒抗性较低，对DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂仍然保持敏感。

摘要：目的　构建血管内皮细胞生长因子受体 (VEGFR)Flt 1和kdr特异性短发夹环RNA(ShRNA)真核表达载体。方法　采用人U6SnRNA启动子 ,分别把被 9bp序列间隔的 19bp长短的Flt 1和kdr靶序列的反向重复序列 ,置于 pEGFP C1质粒载体中 ,分别构建成Flt 1和kdr短发夹环RNA ,产生重组质粒 pEGFP C1/U6/Flt 1及pEGFP C1/U6/kdr。分别用Pst和SalⅠ酶切鉴定 ;并将经酶切鉴定后的重组质粒作测序分析。结果　VEGF受体Flt 1和kdr的ShRNA片段被成功克隆进 pEGFP C1质粒中 ,SalⅠ酶切鉴定可切出 4 0 0bp大小的片段 ,DNA测序分析显示 ,重组质粒ShRNA编码序列与设计片断的序列完全一致。结论　针对Flt 1和kdr的特异性ShRNA真核表达载体PEGF/U6/Flt 1及PEGF/U6/kdr的成功构建 。