摘要：目的:运用CRISPR/Cas9基因编辑工具研究靶向SW620细胞系中kras或TP53突变对细胞增殖活性的影响。方法:针对SW620细胞中kras和TP53的突变位点设计sgRNA,并利用TIDE法检测sgRNA的切割效率。通过细胞增殖实验检测靶向kras或TP53突变后SW620细胞增殖活性的改变,并应用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡水平的变化。结果:分别构建了靶向SW620细胞系中kras和TP53突变的sgRNA质粒,并通过TIDE分析验证了sgRNA的内源切割效率;细胞增殖实验及细胞凋亡检测显示,靶向突变的kras或TP53基因后,SW620细胞增殖活性明显减弱,凋亡水平明显升高(P<0.05)。结论:本研究基于CRISPR/Cas9技术实现了对SW620细胞系中突变的kras和TP53的基因编辑,发现靶向kras或TP53突变能够明显抑制SW620细胞的增殖活性并促进细胞凋亡,为结直肠癌相关靶点治疗提供了体外实验依据。

摘要：基于微滴式数字聚合酶链式反应(Droplet digital polymerase chain reaction,dd PCR)设计一种检测肠癌游离循环DNA(Circulating cell free DNA,cf DNA)中kras(V-Ki-ras2 Kirsten ratsarcoma viral oncogene homolog)基因突变的新方法并评估其灵敏度和准确性。根据肠癌病人kras基因的突变类型设计并合成,采用dd PCR扩增并评估其灵敏度和准确性;根据AMRS-PCR引物设计原理设计kras基因的实时定量PCR扩增引物并评估其准确性,进而比较dd PCR和q PCR二者之间的优缺点;最后针对52例肠癌病人的cf DNA采用dd PCR进行检测,研究dd PCR在cf DNA kras基因突变检测的应用。成功使用dd PCR和q PCR两种方法对kras野生型及7种突变型建立检测方法,使用质粒标准品及实际样品验证该两种方法可行并对其假阳性率、线性范围及检测下限等性能进行了评价,最后成功对52例临床患者和20例正常人的血浆cf DNA样本进行检测,临床灵敏度为97.64%,临床特异性为81.43%。dd PCR的检测性能优于q PCR,LOD达到个位数DNA拷贝,最低可确认突变浓度达到0.01%–0.04%。样本提取效率在方法学建立中也十分重要,直接影响到灵敏度和Cut Off值的判定。临床患者检测结果显示其kras突变率接近报道水平。

摘要：目的:探讨结直肠癌组织中kras、NRAS及BRAF基因突变状态与临床病理特征的关系。方法:选取接受根治手术治疗的1205例结直肠癌患者的肿瘤组织标本,采用突变扩增阻滞系统检测kras、NRAS、BRAF基因的突变状态。1205例患者中,0.05),在<40岁的患者中未检出。原发于右半结肠、黏液腺癌、低分化、肿瘤最大径≥4 cm、有淋巴结转移、pTNM分期Ⅲ/Ⅳ期的癌组织中BRAF基因突变检出率更高(P<0.05)。结论:kras基因突变与结直肠癌组织学类型和肿瘤分化程度关系密切,BRAF基因突变与多种不良预后相关临床病理特征关系密切。

摘要：目的采用二代测序技术(next-generation sequencing,NGS)检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中EGFR、ALK、kras等驱动基因突变情况,分析NGS与其他基因突变检测技术结果的一致性,探讨NGS对临床诊疗的意义。方法通过Illumina MiniSeq测序平台检测NSCLC中10种驱动基因突变情况,分析其与临床病理特征的关系,并将EGFR、ALK、ROS1检测结果与临床分子病理标准检测方法结果进行一致性分析。结果10基因突变联合检测结果显示:209例NSCLC中,总体突变阳性率为69.9%,EGFR突变阳性占比最多(37.6%),其次是ALK(13.1%)和kras(11.3%),其余突变类型占比为8.1%,检测发现双基因共存突变EGFR/ROS1、EGFR/PIK3CA、ALK/BRAF各1例。本次NGS检测EGFR突变、ALK融合突变及ROS1融合突变的结果与临床标准检测方法结果高度一致。结论采用NGS对NSCLC驱动基因突变的检测有极高的准确性,而且可以全面了解基因突变状态,有利于临床靶向治疗方案的选择。

摘要：RAS(rat sarcoma)是肿瘤中常见的突变基因之一,kras(kirsten rat sarcoma viral oncogene)是RAS家族中的3种亚型之一。长期以来,采用传统小分子抑制剂难以有效抑制RAS的相关功能,因此RAS蛋白也被称为"不可成药的靶标"。然而,近年来发现kras基因中的常见突变G12C(12位的甘氨酸突变为半胱氨酸)有助于设计合成共价抑制剂从而为有效靶向"不可成药"的RAS带来了新希望。基于kras^(G12C)突变设计合成的共价抑制剂取得巨大的进展。目前至少有3种kras^(G12C)共价抑制剂处于临床开发阶段,其中Amgen公司研发的AMG510已进入Ⅲ期临床阶段,且治疗效果显著。此外,可逆的kras抑制剂和降解kras^(G12C)的PROTAC类化合物也取得了突破进展。除单药治疗外,kras^(G12C)也开启了与其他靶点的联合治疗。本文综述了近年来kras^(G12C)小分子抑制剂的研究进展。

摘要：目的论证kras假基因对kras基因突变检测结果存在潜在性影响。方法检测5个确证结直肠癌的肿瘤组织序列,并以序列比对的方式对krasP1与kras基因进行同源性比较与分析。结果 krasP1与kras存在高度同源性。在kras基因突变检测的实验中,krasP1的存在对扩增类反应产生一定的不良影响,影响程度与检测方法的类型以及实验的设计有关。结论 krasP1的产生与其原始序列可能是来自于同期的kras基因的一个转录本,并随着时间的推移逐渐差异化,但仍保留着大部分的相似性,并有进一步的分析所证实。krasP1对kras基因突变检测结果存在潜在影响,如何避免同源性干扰将取决于分子诊断方法的实验设计。

摘要：RAS是人类癌症中最常发生突变的致癌基因,而kras则是RAS家族中最常发生突变的亚型,其中多数为12位密码子的突变。突变之后的kras使细胞的生长、增殖不受控制,进而导致癌症的发生与发展。尽管经过了30多年的努力,但直接靶向kras活性位点的药物开发均以失败告终。由于kras与GTP的亲和力极强,同时细胞中GTP浓度较高,以至于使kras成为"不可成药"靶点。近期,针对突变的kras G12C特异性共价抑制剂在临床试验中取得了突破性进展,为kras抑制剂的可成药性提供了临床证据。综述kras的结构功能及其小分子抑制剂的设计和临床研究概况,着重介绍具有代表意义的kras G12C抑制剂和其作为抗肿瘤药物的最新研发进展,为以kras为靶点的药物开发提供研究思路。

摘要：目的 建立一种适用于临床的kras基因直接测序突变检测方法.方法 以kras基因12、13密码子为突变检测靶位点设计特异性扩增、测序引物,以已知12、13密码子野生型、突变型样品分别做为阴、阳性对照品,建立kras基因突变直接测序检测方法,并行方法学评估.结果 成功建立了kras基因突变直接测序检测方法,该方法检测灵敏度达3.9 ng/μl,重复性良好.检测17例结直肠癌样品,突变率为23.5％.结论 本研究成功建立了可用于临床样品检测的kras基因突变直接测序检测方法.

摘要：Adagrasib(研发代号:MRTX-849)是Mirati Therapeutics在研针对kras G12C突变的共价抑制剂,不可逆、选择性地与kras G12C位点共价结合,将其锁定在失活状态,达到治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的目的。Adagrasib目前正在同步进行临床Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期试验,2021年6月,美国食品药品管理局授予Adagrasib"突破性疗法"资格认定,用于治疗kras G12C突变的NSCLC患者。本文主要针对Adagrasib的基本信息、作用机制、有效性及安全耐受性等方面作概述。

摘要：目的构建以kras为靶标的抗结肠癌药物筛选系统,为抗结肠癌药物筛选提供新的技术手段。方法首先选取细胞系并确定系统的技术参数,构建以kras为靶标的抗结肠癌药物筛选系统,设计实验验证筛选系统的有效性;而后将构建的筛选系统初步应用,筛选化合物库Z183593-L1200,并对筛选结果进行验证,验证筛选系统的可行性。结果完成筛选系统构建后,通过筛选系统(in-cell Western blot)测得的Hce8693和T47D细胞的kras表达差异与普通Western blot一致,筛选系统测定的siRNA系统的敲低效率与普通Western blot亦一致,筛选系统的有效性得到初步验证。筛选激酶抑制剂化合物库Z183593-L1200后,选取活性最好的化合物PF-04691502进行验证;浓度梯度实验显示,随着PF-04691502浓度升高则kras胞内含量降低,kras胞内含量对PF-04691502浓度呈梯度依赖性;细胞增殖实验结果显示PF-04691502对Hce8693细胞的半数有效浓度(IC50)为3.546μmol/L,进一步验证了系统的可行性。结论所构建的以kras为靶标的抗结肠癌药物筛选系统具有一定有效性和可行性,能够用于以kras蛋白为药物靶点的药物高通量筛选,为抗结肠癌的药物研发提供了新的筛选方法。