摘要：目的建立一种kras基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测方法,并初步探讨其临床应用价值。方法以kras基因热点突变区域12、13密码子为研究位点设计特异性扩增、测序引物,利用已知野生型、突变型样品以TA克隆技术构建相应质粒作为标准品,建立kras基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测方法,并进行方法学和应用评估。结果成功构建了kras基因12、13密码子野生型、突变型质粒。建立了kras基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测方法,该方法灵敏度高(9.39×101copies/uL),重复性好(实时荧光定量PCR部分批内、批间变异系数分别为1.60%、2.54%)。该法与传统Sanger测序法同时检测40例临床样品,结果符合率为100%。结论本研究成功建立了可用于临床样品检测的kras基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测方法。

摘要：目的该文旨在研究一种适用于数字PCR在kras基因突变液态活检中的灵敏度评价方法 ,并通过临床样本的检测结果验证灵敏度算法的可行性。方法 2016年11月基于微滴式数字PCR平台设计引物探针建立kras检测方法,确定其检测下限、定量下限、变异系数。2017年1月比较了数字PCR 3种不同检测下限统计算方法。结果成功建立微滴式数字PCR对kras突变检测方法。在3种检测下限计算方法结果对比后选择了保守性居中的算法。结论数字PCR是一种灵敏精确的基因突变检测方法,其检测下限可使用基于假阳性率的泊松分布算法进行量化评价,且综合检测性能适用于临床液态活检的需求。