摘要：目的对新城疫病毒Tl1株l基因进行克隆、序列分析及真核表达载体构建。方法根据GenBank登录的新城疫病毒l基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR对内蒙古分离株Tl1的l基因进行整体扩增。将扩增产物提纯后,克隆入pGEM-Teasy载体,再亚克隆至真核表达载体pCI-neo上,通过酶切、PCR鉴定及测序进行验证。结果测序拼接得出l基因的全序列长度为6704bp,该基因的ORF总长为6615bp,编码2204个氨基酸。与GenBank登陆的12株参考毒株比较l基因编码区全核苷酸序列和氨基酸序列,发现Tl1株与鹅源新城疫NA-1株、ZJ1株和SF02株的同源性极高,说明四者亲缘关系较近。结论已成功构建l基因真核表达载体,为对该株病毒进行反向遗传操作以及有关功能基因组研究奠定了基础。

摘要：为原核表达汉坦病毒(HV)l蛋白,本研究根据HV 76-118株全长l基因序列分段设计合成了6对引物。通过RT-PCR方法分段扩增l基因的6个片段,分别克隆于原核表达载体pET-30a中,并转化到大肠杆菌Bl21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE分析表明,获得与预期分子量一致的特异的目的蛋白。Western blot检测表明,重组蛋白与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应。

摘要：设计了 2对引物V4l1、V4l2和V4l3、V4l4 ,用RT PCR法对新城疫病毒 (NDV )V4克隆株的l基因进行了分段克隆。用V4l1、V4l2扩增出约 4 .1kb的V 4lA片段 ,用V4l3、V4l4扩增出约 3.5kb的V 4lB片段 ,分别对克隆出的 2个片段进行序列测定 ,并用DNAsis软件比较分析后进行拼接 ,得到长约 7.2kb、包含有NDVV4克隆株l基因全长的核苷酸序列。NDVV4克隆株l基因mRNA全长为 6 70 4bp ,拥有 1个 6 6 15bp的开放阅读框 ,推测其编码的氨基酸数为 22 0 4个。氨基酸同源性分析表明 :V4克隆株与HB92V4株l基因的同源性为 99.0 % ,与laSota、B1、B1T(美国Takaaki分离株 )、BeaudetteC、Clone30、F4 8E9、SF0 2和ZJ1株的同源性为 94 .1%～96 .5 %。

摘要：本研究以新城疫病毒(NDV)l蛋白的功能区(P1595、P2103和P3277酶活性中心结构区)序列为RNAi的靶位点,设计、构建了3个特异性的siRNA的真核表达质粒pSi-l6、pSi-l7和pSi-l9,转染到CEF细胞后接种NDV,间接免疫荧光实验结果显示:pSi-l6、pSi-l7和pSi-l9均能抑制NDV抗原蛋白的表达;Real-timePCR检测到转染pSi-l6、pSi-l7和pSi-l9的CEF细胞中l基因的转录水平分别降低79.1%、93.9%和91.3%,P基因的转录水平分别降低73%、86.3%和89.8%;病毒滴度测定表明转染pSi-l6、pSi-l7和pSi-l9质粒的细胞培养上清中病毒的滴度分别低2.19、3.16和5.24倍。本研究中3个特异性的siRNA均能抑制NDV的复制、增殖,表明P1595、P2103和P3277这3个区域对于l蛋白发挥RNA依赖的RNA聚合酶的功能具有重要作用。

摘要：根据GenBank登陆的新城疫病毒l基因序列，设计了3对引物（l1和l2、13和14、l5和l6）。用***技术对3株新城疫病毒广西分离GX7／02、GX9／03、GX11／03的l基因进行了分段扩增和克隆，并对克隆出来的3个片段进行序列测定，用DNAstar软件比较分析后进行拼接，得到长约为6．8kb、包含有l基因全长的核苷酸序列。l基因的RNA全长为6704bp，拥有一个6615bp的开放阅读框，推导其编码的氨基酸数为2204个。氨基酸同源性分析表明广西分离株之间同源性为98．6％～98．7％；与ZJ1株同源性为98．8％～98．9％；与la-Sota、B1、F48E9、HB92同源性为92．0％～94．2％。

摘要：根据GenBank中已发表的鹅副粘病毒GPV-SF02株全基因组序列设计5对引物,采用RT-PCR扩增出白鹭源禽I型副粘病毒(W13株)l基因的lA(1121 bp)、lB(1481 bp)、lC(1439 bp)、lD(1476 bp)、lE(1608 bp)5个片段,用DNA Star软件比较分析后进行拼接,获得长约6760 bp包含有l基因全长的核苷酸序列,而W13株l基因的mRNA全长为6704 bp、开放阅读框(ORF)为6615个碱基、编码2204个氨基酸。氨基酸同源性分析表明:W13株l基因与鹅源SF02、ZJl、NA-1株及鸡源Guangxi7株的同源性均超过97.0%;而核苷酸同源性分析表明:W13株l基因与鹅源SF02、ZJl、NA-1株及鸡源Guangxi7株的同源性均超过93.0%。可见,W13株与鹅源SF02、ZJl、NA-1株及鸡源Guangxi7株的亲缘关系较近。

摘要：通过基因工程手段抑制脂肪酸延长酶基因fae1的表达,以阻止芥酸合成,培育不受高芥酸窜粉影响的低芥酸品种。利用GenBank中的fae1基因序列AF490462为模板设计引物和多聚酶链式反应(PCR)从白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的12个不同品种中扩增出长1007bp的fae1基因片段,通过对fae1基因片段DNA序列的测定和序列比较,找到长度为428bp高度保守区作为RNA干涉(RNAi)的靶标区。根据RNA干涉(RNAi)双向表达载体设计原则,将428bpfae1基因片段以正反两个方向插入双向表达载体pMCG161中,两个片段用一个wax基因的内含子连接,植物筛选标记基因采用bar基因,从而构建以油菜fae1基因为靶标的RNAi载体。

摘要：为研究新城疫病毒NP、P和l蛋白作用机理和新城疫病毒反向遗传操作系统,构建新城疫病毒Clone 30株NP、P和l基因的真核表达载体。根据Gen Bank中新城疫病毒Clone 30株的全长序列(Y18898.1),设计3对特异性引物,用RT-PCR法扩增出新城疫病毒Clone 30株的NP、P和l基因,将其克隆到真核载体pCI-neo上。通过酶切和测序验证克隆正确,得到重组质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-l,瞬时转染到BHK-21细胞中。经RT-PCR、Western blot、间接免疫荧光试验分别检测NP、P和l蛋白在BHK-21细胞中的表达。结果表明,重组质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-l构建成功,为后期新城疫病毒反向遗传操作系统的构建奠定了基础。

摘要：为了建立一种能够鉴别检测裂谷热病毒野毒株与NSs缺失型疫苗株的荧光定量RT-PCR方法,本研究通过对裂谷热病毒基因组序列进行比较分析,选择其S节段NSs基因及l节段l基因的无二级结构且保守的区段,分别设计多对引物和探针,通过试验验证并优化反应条件,筛选出最佳引物和探针的组合,建立了可以快速检测裂谷热病毒并区分NSs基因缺失疫苗株和野毒株的双重荧光定量RT-PCR方法。利用该方法检测羊临床常见病原,结果显示该方法仅对裂谷热质粒标准品样品检测为阳性,不与羊常见的其他病原出现阳性反应,特异性强;将裂谷热质粒标准品10倍倍比稀释后利用本研究建立的方法进行检测,结果显示,该方法对NSs和l基因重组质粒标准品的检测下限分别为10拷贝/μl和100拷贝/μl,敏感度高;重复性实验结果显示,该方法组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。将NSs缺失型和非缺失型质粒分别转染细胞,提取核酸,利用本方法进行检测,结果显示该方法可有效区分NSs基因缺失型和非缺失型核酸样品。本研究建立的双重荧光定量RT-PCR方法为鉴别野生病毒株和NSs缺失型疫苗株奠定了技术基础。

摘要：本研究旨在检测家兔Nrampl基因mRNA在不同组织中的表达水平，为进一步阐明家兔Nrampl基因的生物学功能提供有用的方法和信息。根据GenBank中家兔Nrampl基因序列设计引物，采用基于SYBRGreenI的Real—time PCR对家兔心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、盲肠、回肠、淋巴结、肌肉、脂肪和大脑中Nrampl表达水平进行了定量分析。