摘要：用重组DNA技术获取人乳头瘤病毒(HPV)16型晚期基因l1.以提取的宫颈癌细胞株Caski细胞总DNA为模板,设计一对l1基因特异引物,用PCR方法扩增HPV16 l1重组基因,用柱层析技术纯化和酶切初步鉴定HPV16 l1重组基因.该方法不仅可以扩增出HPV16 l1重组基因,用层析技术纯化HPV16 l1重组基因,还能通过酶切鉴定PCR产物HPV16 l1全长基因,为HPV感染的检测诊断和宫颈癌疫苗的制备奠定基础.

摘要：目的:比较宫颈组织人乳头瘤病毒16亚型中HPV早期基因(E6/E7)和晚期基因(l1)的检出情况,并分析其作为宫颈癌及癌前病变评价的意义。方法:选择高危型(HR)-HPV16亚型的E6/E7区基因和HR-HPV的l1区基因设计特异性引物,优化条件,建立高危型HPV16分型检测方法。分别收集宫颈组织慢性宫颈炎22例,宫颈上皮内瘤变、宫颈鳞癌54例共76例组织标本,根据病理学诊断结果分为两组,对照组(慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(CINⅠ级)和高级别宫颈病变组(CINⅡ级、CINⅢ级、宫颈鳞癌),抽提DNA,采用新建立的方法对HPV早、晚期基因进行PCR检测,同时与临床的杂交捕获二代法(HCⅡ)检测的HPV l1基因进行比较。结果:成功建立了敏感、特异的基于E6/E7和l1基因的PCR检测方法,E6/E7基因HPV16分型检测阳性率为55.3%(42/76),HPV l1和HCⅡ-HPV l1检测阳性率均为25.0%(19/76),E6/E7基因阳性率明显高于HPV l1和HCⅡ-HPV l1,差异有统计学意义(P0.05)。对照组的HPV E6/E7、HPV l1和HCⅡ-HPV l1阳性率分别为29.0%、9.7%和12.9%,显著低于高级别宫颈病变组的73.3%、35.6%和33.3%(P0.05)。结论:HPV E6/E7基因比l1基因检测更具灵敏、高效、实用的特点,将E6/E7基因HPV16亚型阳性检测结果与CINⅡ以上病理诊断结果相结合,可作为预测评价临床早期宫颈病变及宫颈癌的有效方法之一。

摘要：目的:构建人乳头瘤病毒16型l1基因和蛋白转导肽基因Tat的融合表达载体,以大肠杆菌作为表达系统,探索制备经济而高效的人乳头瘤病毒疫苗的新方法。方法:以pBR322-HPV16质粒为模板扩增l1基因,与原核表达载体pET28a连接,重组质粒再与自行设计蛋白转导功能片段Tat连接,经测序鉴定后转入大肠杆菌表达菌株DE3进行诱导表达Tat-HPV16l1融合蛋白。结果:融合基因Tat-HPV16l1测序结果与预期完全符合,经过IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析,结果诱导表达成功。结论:本研究为制备经济而高效的人乳头瘤病毒疫苗打下了基础。

摘要：目的构建人乳头瘤病毒16型l1基因和蛋白转导肽的Tat基因的融合表达载体,导入酿酒酵母表达系统进行诱导表达,为口服基因疫苗的制备打下基础。方法以pBR322-HPV16质粒为模板扩增l1基因,与酿酒酵母表达载体pYES2连接,重组质粒再与自行设计的蛋白转导功能片段Tat连接,经测序鉴定后转入酿酒酵母表达菌株INVSc1诱导表达Tat-HPV16l1融合蛋白。结果融合基因Tat-HPV16l1测序结果与预期完全符合,经过半乳糖诱导表达后进行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析,结果表明诱导表达成功。结论成功构建和表达了融合表达载体pYES2-Tat-HPV16l1,为制备以酿酒酵母为运送载体的口服人乳头瘤病毒疫苗打下基础。

摘要：从核酸和抗体水平对我国东部5省猪呼肠孤病毒的流行情况进行研究。针对l1基因设计特异性引物,成功建立了猪呼肠孤病毒巢式反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测方法,利用该方法对2013—2014年从浙江、江西、山东、河南、黑龙江等5省共58个猪场采集的224份腹泻猪粪便样品进行检测。同时,建立了血清型3型哺乳动物呼肠孤病毒(mammalian orthoreovirus,MRV)中和抗体检测方法和以病毒衣壳蛋白δ1重组蛋白为包被抗原的间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ElISA)的血清学检测方法,并利用该方法分别测定了37份腹泻猪血清样品中和抗体滴度和抗σ1 Ig G抗体水平。结果表明,从55个猪场中共检出147份阳性样品,猪场阳性率和样品阳性率分别为94.8%和65.6%。在37份血清样本中,中和抗体效价高于4的有33份(89.2%);而采用间接ElISA方法测定在450 nm处的吸光度值高于临界值(0.32)的样品为32份(86.49%),二者具有较好的相关性:说明建立的间接ElISA检测方法比较可靠。此外,利用建立的间接ElISA方法检测了2015—2016年从江西、河南、浙江、黑龙江和山东等省收集的262份具有腹泻症状的母猪、初生仔猪和3周龄断奶仔猪血清样品。结果表明,抗σ1 Ig G抗体检出率为84.4%。根据核酸和抗体水平检测结果,我们认为呼肠孤病毒广泛存在于中国东部5省各个猪场中,应该引起足够的重视。

摘要：【目的】明确广西黄牛是否存在牛乳头状瘤病毒(Bovine papillomavirus,BPV)感染,为今后制定科学的防控措施提供参考依据。【方法】从广西隆安县某黄牛养殖场青年黄牛的皮肤上采集瘤状物病料,在临床观察和组织病理学观察的基础上,采用PCR对其进行鉴定和基因型分型,再根据鉴型结果设计5对特异性引物对BPV基因组进行扩增及测序分析。【结果】黄牛皮肤瘤状物的病理组织切片观察发现,表皮与真皮增生,表皮细胞角质化和空泡化,细胞呈梭形或星形。从瘤状物中分离获得1株毒株,其与BPV-1型的同源性达99.0%,命名为BPV-GX-lA150909。BPVGX-lA150909毒株基因组全长7946 bp,Gen Bank登录号为MF435918,包含早期基因区(E区)、晚期基因区(l区)和非编码区(NCR区)3个区域。BPV-GX-lA150909毒株无论是其基因组还是l1基因,均与BPV-1型的同源性最高,尤其与贵州株BPV-1 GZlZ的同源性分别为99.9%和99.7%,且在系统发育进化树上也是与BPV-1 GZlZ的遗传距离较近。BPV-GX-lA150909毒株的l1蛋白具有潜在的B细胞抗原表位,含有17个O-糖基化位点和1个N-糖基化位点。【结论】广西黄牛群中已存在BPV-1型感染,且与国内外BPV-1型的同源性较高,说明BPV跨地区传播是不可忽视的问题。

摘要：目的对HPV18型DNA疫苗的免疫原性和安全性进行初步评价。方法将HPV18l1基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建DNA疫苗质粒pcDNAl1。使用脂质体将重组质粒转染COS7细胞,用Westernblot检测体外瞬时表达的抗原。将重组质粒pcDNAl1肌肉注射BAlBc小鼠(100μg只),加强免疫3次后分别采集血清,用ElISA法和Westernblot法检测抗体,实时荧光定量PCR法检测质粒的组织分布。采用ElISA法检测DNA疫苗免疫后抗核抗体和抗双链DNA抗体的效价。结果重组质粒可在真核细胞中有效地转录和表达HPV18l1蛋白。小鼠免疫后可检出较高滴度的抗HPV18l1抗体和特异条带。免疫后质粒主要分布在注射部位,且随着时间延长被清除;未检测到抗核抗体和抗双链DNA抗体。结论HPV18l1重组质粒可诱导小鼠产生特异的体液免疫反应,且该DNA疫苗是安全的,为进一步研制开发HPVDNA疫苗打下了基础。