摘要：目的构建ll-37慢病毒过表达载体,稳定转染RAW264.7细胞株,并检测ll-37在胞内mRNA和蛋白表达情况。方法根据GenBank数据库获取抗菌肽ll-37的蛋白编码基因序列,同时选择合适的酶切位点并设计特异性的上、下游引物,PCR扩增目的基因。用SalI、Age I限制性内切酶对载体和目的基因进行双酶切,将酶切目的片段与载体进行重组。重组质粒冰水浴30 min、42℃热激1.5 min、冰上放置2 min后转化入DH5α感受态细胞。将感受态细胞在不含氨苄的LB培养基中,37℃、200 r/min培养1 h。将转化菌在含氨苄平板上进行筛选,阳性菌落进行PCR和测序鉴定,鉴定正确的菌落进行扩增并大量抽提质粒。将20μg GV载体质粒、15μg pHelper 1.0载体质粒、10μg pHelper 2.0载体质粒与转染试剂混合后共转染293T细胞,收集细胞上清液,经离心、过滤后保存。将包装浓缩后的慢病毒按照MOI=100稳转RAW264.7细胞株,并用嘌呤霉素筛选ll-37慢病毒过表达RAW264.7细胞株。分别采用RT-PCR和间接免疫荧光技术检测转染成功的RAW264.7细胞中mRNA和蛋白表达情况。结果成功获得7487 bp的线性化载体和164 bp的ll-37PCR片段,成功构建ll-37慢病毒过表达载体。将重组质粒转化到DH5α感受态细胞中,经PCR和测序鉴定重组质粒构建正确。经包装浓缩后的慢病毒成功稳转RAW264.7细胞株,并用嘌呤霉素筛选出ll-37慢病毒过表达RAW264.7细胞株。RT-PCR检测携带重组质粒的慢病毒转染的RAW264.7细胞,胞内mRNA有良好表达丰度,ll-37基因的表达丰度为9074.883(P<0.01)。加入ll-37抗体的细胞株组在CQ1荧光拍照下能够观察到荧光,空白组和阴性对照组无此荧光,表明稳转ll-37 RAW264.7细胞株构建成功。结论成功构建ll-37慢病毒过表达载体并获得在胞膜及包浆均有大量表达ll-37的慢病毒稳转RAW264.7细胞株,为ll-37相关作用机制研究奠定了基础。

摘要：目的研究溶液p H变化对抗菌肽ll-37结构的影响。方法利用分子动力学模拟方法,采用GROMACS软件包和OPLS-AA力场,分别在中性和强碱性条件下对ll-37进行模拟,总模拟时间达1微秒,最后对模拟轨迹进行分析处理。结果ll-37在中性环境下具有部分螺旋结构存在,特别是N端部分残基,结构具有较大柔性;在强碱性环境下,螺旋含量增多,抗菌核心区域残基形成螺旋结构的几率明显增大,结构稳定性增强。结论 p H值的增大会促进ll-37螺旋结构的形成,螺旋结构的形成和与膜结合是协同的。N端残基易形成螺旋,然后是抗菌核心区域。ll-37在中性环境下的结构特征与其行使多功能的角色相一致。该研究首次分析了ll-37在中性环境下的结构特征及p H的影响,有助于认识其抗菌机制及新药设计。

摘要：目的将改良人源杀菌肽ll-37(rll-37)用两种方法构建,并分别在原核细胞中融合表达,以寻找较好的制备方法。方法①将编码rll-37基因序列放入载体pET-28a(+),构建表达质粒pET-28a(+)-rll-37,并于工程菌BL21(DE3)中融合表达、纯化;②将编码rll-37基因序列中的部分原核细菌稀有密码子替换为原核细菌偏爱密码子,并在其N端加入一段编码带负电荷的承载蛋白(carrierproteinmolecule,CPM)基因序列,构建表达质粒pET-30a(+)-CPM-rll-37,并于工程菌BL21Star(DE3)中融合表达、纯化。对比上述2种方法rll-37的制备率,并初步研究其抗菌性。结果通过Touch-DownPCR法成功获得rll-37多肽的DNA序列,质粒pET-28a(+)-rll-37于杆菌BL21(DE3)中表达,融合蛋白约占全菌蛋白的20%,并成功由强阳离子交换柱芯Macro-PrepHighS纯化;设计了一段含28个氨基酸残基的CPM(pHi2.7、pH7.4时电荷为-6.0),成功构建表达质粒pET-30a(+)-CPM-rll-37,并于杆菌BL21star(DE3)中表达,融合蛋白约占全菌蛋白的35%,并被TALON亲和柱芯有效纯化。经抑菌圈实验证明两种方法所获得的rll-37多肽对G+、G-菌都具有较好的杀菌力。结论rll-37在原核细胞中的高效表达,为深入研究rll-37的杀菌活性奠定了基础。

摘要：通过密码子优化,在毕赤酵母中高效表达人ll-37与IFN-α2a融合蛋白。先按***密码子偏好性对ll-37与IFN-α2a的原始密码子进行了改造,并在二者之间加上Gly Gly Gly Gly Ser的柔性连接接头,人工合成设计的新序列,最后通过p PIC9K载体将其整合入*** GS115的基因组,构建出重组菌株GS115LI。利用遗传霉素浓度梯度筛选出两株高拷贝的GS115LI1和GS115LI2菌株。对这两株菌经发酵诱导后的发酵液进行SDS-PAGE检测、抗病毒活性检测和抗菌活性检测,证明重组株既能够成功表达出ll-37与IFN-α2a的融合蛋白,而且该融合蛋白成功保留了抗菌肽与干扰素的功能活性。诱导发酵后,融合蛋白的产量可达到819.1 mg/L,经盐析、疏水层析和离子交换层析分离,可得到纯度达97%的融合蛋白产物,回收率可达到46.2%,纯化后产品的效价可达2.6×108 IU/mg。经过密码子优化后,成功实现在毕赤酵母中高效表达出既有ll-37抗菌活性又具有干扰素α2a活性的融合蛋白。

摘要：首次设计开发一种促愈合,抗细菌感染的多肽分子——人源抗菌肽ll-37修饰haFGF的融合蛋白,旨在探讨此新型融合蛋白ll-37-haFGF的复性及纯化条件。利用重组大肠杆菌表达ll-37-haFGF并鉴定,初步考察8种复性添加小分子对其包涵体复性的作用,经分析表明,添加0.3 mol/L精氨酸可以大大提高ll-37-haFGF的复性效率。经镍亲和色谱及CM阳离子色谱纯化获得纯品。本研究获得了5.9 mg纯度为95.43%的ll-37-haFGF目的蛋白,为研究其功能奠定了基础,也为类似的双功能多肽的制备提供了参考依据。

摘要：抗菌肽(AMPs)是一大类天然抗生素,其中,包括防御素和cathelicidins。ll-37是唯一一种人源的cathelicidin,因其卓越的能力而备受关注。在这篇综述中,我们介绍了ll-37作为治疗剂的效力,并且详细讨论了从三个方面对ll-37进行优化的策略:设计优化抗菌肽模板、建立给药递送系统以及药物联合应用。ll-37作为一种具有临床应用价值的药物显示出巨大的潜力,未来的研究应该集中在新型药物传递系统的设计、药物释放的分子基础的理解、AMPs的基因工程和开发新的联合治疗方法。

摘要：目的探讨血清维生素D水平、抗菌肽ll-37水平与新生儿败血症的相关性。方法采用前瞻性设计,46例新生儿败血症患儿作为研究组,40例健康足月新生儿作为对照组。2组新生儿均在产后72 h内采血进行25-(OH)D_3水平及ll-37水平检测。结果新生儿败血症患儿维生素D水平(9.01±4.39)ng/mL明显低于对照组的(17.23±5.7)ng/mL(P<0.05);抗菌肽ll-37水平(385.31±178.96)ng/mL明显低于正常组的(498.82±201.99)ng/mL(P<0.05);研究组患儿血清25-(OH)D_3水平与ll-37水平呈显著正相关性(r=0.594,P<0.05)。结论低血清25-(OH)D_3水平与新生儿败血症的发生具有相关性,维生素D的缺乏可能是新生儿败血症患儿抗菌肽ll-37表达下调的重要原因。