摘要：为了构建POR基因稳定敲除(POR^(KO))、回补(PORCO)、过表达(POR^(OE))的lo2细胞株,以便为后续深入开展POR基因在AFB_(1)致毒性机理中的功能研究提供细胞模型。本研究首先利用CRISPR/Cas9技术设计2条靶向POR基因的sgRNA并克隆至lentiCRISPR v2载体,进行慢病毒包装与感染,筛选出lo2 POR^(KO)单克隆细胞后进行测序及Western blot鉴定。其次用同源重组方法构建pcDNA3.1(+)/myc-His B-POR重组质粒,经对POR^(KO)细胞和野生型细胞转染分别构建lo2 PORCO及lo2 POR^(OE)细胞株,以G-418筛选后进行Western blotting鉴定。再用4μmol·L^(-1)及8μmol·L^(-1)AFB_(1)分别对野生型、lo2 POR^(KO)、lo2 PORCO、lo2 POR^(OE)细胞株染毒48 h,观察细胞形态并测定细胞存活率。结果表明,靶向exon5的sgRNA-2可成功敲除POR基因,得到lo2 POR^(KO)细胞株;成功构建表达POR重组蛋白的lo2 PORCO及lo2 POR^(OE)细胞株。对AFB_(1)处理后的各细胞存活率测定结果表明,相较于野生型lo2细胞43.66%±0.58%和27.90%±0.46%的存活率,lo2 POR^(KO)细胞存活率具有极显著性差异,均为100%(P<0.0001);lo2 PORCO细胞存活率仍有显著性差异,分别为57.07%±0.74%和42.54%±0.68%(P<0.05);lo2 POR^(OE)细胞存活率则显著降低,分别为24.58%±0.92%和17.99%±0.81%(P<0.01)。综上所述,本研究成功构建了lo2 POR^(KO)、lo2 PORCO、lo2 POR^(OE)细胞株,并以AFB_(1)染毒处理分别研究了各细胞株的存活率和细胞形态学变化,发现POR基因对AFB_(1)所致细胞毒性的影响巨大。研究结果为后续深入开展POR基因在AFB_(1)致毒性机理中的功能研究奠定了基础。

摘要：目的利用CRISPR/Cas9在肝癌细胞HepG2及正常肝组织细胞(lo2)中敲低RBBP4 eGFP报告基因,构建RBBP4低表达的HepG2及lo2稳定细胞系.方法基于CRISPR/Cas9系统原理,设计靶向细胞RBBP4基因第1个外显子的小向导RNA(sgRNA),构建具有左右同源臂和P2A-eGFP供体质粒的干扰质粒;将测序鉴定正确的重组质粒分别转染至HepG2及lo2细胞中,通过嘌呤霉素筛选细胞系,提取RNA和蛋白,分别通过QPCR和蛋白质印迹分析检测RBBP4敲低对细胞系的影响.结果QPCR及和蛋白质印迹分析结果提示筛选的HepG2及lo2细胞系中RBBP4基因及蛋白表达减低(P<0.05).结论通过CRISPR/Cas9系统成功构建了RBBP4稳定敲低的HepG2及lo2细胞系.