摘要：目的构建并鉴定针对lrig3基因的小干扰RNA(lrig3-siRNA)腺病毒表达载体,为膀胱癌基因治疗的研究提供有效的实验工具。方法设计可形成小发夹结构的lrig3-siRNA模板cDNA序列,克隆至缺陷型腺病毒质粒pSilencer-U6neo,构建lrig3-siRNA表达质粒pSilencer-lrig3。鉴定正确后,将pSilencer-lrig3转染至HEK293细胞,包装成复制缺陷型腺病毒pAd-lrig3。大量扩增pAd-lrig3,氯化铯梯度离心纯化,测病毒滴度。pAd-lrig3感染人膀胱癌细胞T24,RT-PCR法检测lrig3 mRNA的表达。结果酶切分析、测序鉴定表明pSilencer-lrig3构建成功,PCR分析表明pAd-lrig3含有lrig3-siRNA序列。pAd-lrig3可抑制lrig3 mRNA的表达。结论含有lrig3-siRNA的重组腺病毒构建成功,且具有抑制lrig3基因mRNA表达的功能。

摘要：目的构建lrig3(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 3,lrig3)基因特异的RNA干扰质粒,为探讨抑制lrig3基因表达对脑胶质瘤细胞生物学行为调控的研究奠定基础。方法根据GenBank数据库提供的lrig3基因核苷酸序列,选择设计2条能转录短发卡RNA(shRNA)的DNA序列,命名为lrig3-shRNA1、lrig3-shRNA2,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为negative-shRNA。并与pGenesil2质粒载体连接,转化感受态大肠杆菌,挑选阳性克隆,抽取重组质粒,使用限制性内切酶SalI酶切电泳,DNA测序鉴定。3种重组表达载体转染胶质瘤细胞系GL15细胞,用G418筛选后挑选单克隆并扩增获得稳定株。逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分别在mRNA和蛋白水平上检测lrig3的表达。结果重组质粒成功转化感受态大肠杆菌,经SalI酶切琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全正确。G418筛选出稳定转染三种质粒的GL15细胞,转染pGenesil2-lrig3-shRNA组细胞lrig3mRNA和蛋白表达明显低于转染pGenesil2-negative-shRNA组。结论成功构建针对lrig3基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制lrig3基因表达,为进一步研究其基因功能奠定了基础。