摘要：目的 观察转染livin反义寡核苷酸（ASODN）对人胆管癌细胞株QBC939细胞livin mRNA和蛋白表达的抑制作用及其对细胞凋亡的影响.方法 设计合成全硫代磷酸化修饰的livin ASODN,脂质体介导livin ASODN转染QBC939细胞,于转染后60h,噻唑蓝（MTT）法检测livin反义寡核苷酸对QBC939细胞增殖的抑制作用,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测转染前后livin mRNA表达的变化；细胞免疫荧光化学检测转染前后livin蛋白的表达变化；膜联蛋白V（Annexin V）-藻红蛋白（PE）流式细胞仪（FCM）法检测转染后细胞凋亡变化.结果 实验分反义（livin ASODN）组、错义（livin NSODN）组、脂质体组、空白对照组.转染后60 h,MTT法显示livin ASODN组能明显促进胆管癌细胞的凋亡（46.41±1.13、3.10 ±0.44、2.66±0.26、0）；RT-PCR显示livin ASODN组livinmRNA表达水平明显低于各对照组（54.96 ±3.00、88.31 ±2.50、85.90±0.62、90.36±2.43）（P＜0.05）；细胞免疫荧光化学法显示livin ASODN组livin蛋白表达明显低于各对照组（39.05±2.52、8.60 ±3.60、6.37 ±2.71、0）（P＜0.05）；流式细胞仪分析结果显示livin ASODN组的细胞凋亡明显高于各对照组[（36.98±4.09）％、（3.77±0.25）％、（7.51±0.30）％、（6.83±0.23）％].结论 脂质体介导转染livin ASODN能特异性抑制QBC939细胞中的livin基因表达,下调livin蛋白的表达,抑制胆管癌细胞增殖,并诱导细胞凋亡.

摘要：目的:构建针对人livin基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,并观察该载体对食管癌细胞livin基因表达的沉默效应。方法:依据siRNA设计原则,分析livin mRNA序列,设计并合成2个livin靶向的发夹状siRNA靶序列,退火后分别连接入pSUPER-neo载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹法将重组质粒转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR检测转染细胞livin mRNA的表达。结果:经过酶切鉴定与测序,构建的靶向livinα和livinβ基因的siRNA载体,结果正确;RT-PCR检测显示,转染细胞livin mRNA的表达水平降低。结论:成功构建沉默细胞livin基因表达的siRNA载体。

摘要：目的构建凋亡抑制蛋白livin两种异构体(livinα和β)真核细胞表达载体pcDNA3.1-livinα和pcDNA3.1-livinβ。方法利用分子克隆技术,首先设计合成扩增livin基因异构体全长cDNA序列的特异性PCR引物,以肺腺癌SPC-A1细胞总RNA为模板,RT-PCR获得livin基因异构体全长cDNA序列,TA克隆将livin全长cDNA序列克隆到T载体上,用限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ双酶切取所需目的片段,然后将该片段插入真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点,最后对产生的重组子进行双酶切、PCR鉴定,并经过测序证实后,构建成为livin基因异构体表达载体(pcDNA3.1-livin)。电穿孔法获得稳定表达livinα和β的A549细胞克隆,Westernblot验证livin蛋白在转染细胞中的表达情况。结果成功获得livinα和livinβ全长cDNA序列,并克隆到真核表达载体pcDNA3.1上;基因转染后,阳性细胞分别表达livinα和β。结论livin基因两种异构体真核表达载体的构建及在细胞中的表达鉴定,为进一步研究livin异构体功能及在肺癌细胞中的抗凋亡效应奠定了基础。

摘要：目的:构建同时沉默livin基因和MTA1基因的小干扰RNA(siRNA)载体。方法:设计livin和MTA1的siRNA靶序列,合成它们互补的寡核苷酸链,分别退火后重组入pRNAT-U6.2载体,得到pRNAT-U6.2-livin和pR-NAT-U6.2-MTA1。AccⅡ和XhoⅠ酶切pRNAT-U6.2-MTA1,回收475bp的MTA1siRNA单元,然后与XhoⅠ和PmeⅠ酶切线形化的pRNAT-U6.2-livin重组,得到pRNAT-U6.2-livin-MTA1,后者用脂质体包被转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR法分别检测转染细胞livin和MTA1基因mRNA的表达情况。结果:针对livin基因和MTA1基因的siRNA的双链寡核苷酸片段分别克隆入pRNAT-U6.2载体,经测序分析插入片段正确。PCR扩增证实MTA1siRNA单元重组入pRNAT-U6.2-livin。RT-PCR检测显示,转染pRNAT-U6.2-livin-MTA1的EC9706细胞livin基因和MTA1基因mRNA表达水平皆明显降低。结论:同时沉默livin基因和MTA1基因表达的siRNA载体构建成功。

摘要：目的:研究特异性小分子干扰RNA(siRNA)沉默骨肉瘤MG-63细胞livin基因对细胞凋亡的影响。方法:设计针对人源livin基因的siRNA,转染至对数生长期的人骨肉瘤MG-63细胞株;RT-PCR检测转染后骨肉瘤MG-63细胞livin基因表达的变化,Western blot检测转染后骨肉瘤MG-63细胞livin蛋白表达的变化,PI染色后流式细胞仪检测转染后细胞凋亡的变化。结果:livin特异性siRNA转染骨肉瘤MG-63细胞后,livin基因表达较空白对照和阴性对照显著减少(0.195±0.019 vs0.539±0.031、0.438±0.029)。Western blot检测结果显示livin蛋白质水平较空白对照和阴性对照显著减少(0.165±0.022 vs0.632±0.034、0.625±0.035)。流式细胞仪检测见siRNA组骨肉瘤MG-63细胞凋亡率较对照组明显增加。结论:RNA干扰能有效沉默骨肉瘤MG-63细胞livin基因表达,促进骨肉瘤MG-63细胞凋亡。

摘要：目的:利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术在裸鼠皮下移植瘤中抑制livin基因表达,探讨RNA干扰用于胃癌治疗的可行性。方法:SGC-7901细胞注射人裸鼠皮下,建立裸鼠皮下移植瘤的模型,设计靶向livin基因的小干扰RNA(Small interference RNA,siRNA),构建重组表达质粒pTZU6+1-siRNA-livin,并导入裸鼠皮下移植瘤中,在体内诱导RNAi,采用RT-PCR和免疫化学检测livin基因表达,Western blot检测Bax和Bcl-2改变。结果:重组质粒pTZU6+1-siRNA-livin导入裸鼠皮下移植瘤后14d瘤体体积明显减小,livin的mRNA和蛋白表达均明显下调。结论:RNA干扰明显抑制了靶基因livin的表达及肿瘤细胞生长,可能与上调Bax的表达、下调Bcl-2,从而诱导肿瘤细胞凋亡有关。

摘要：目的:通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)阻断胶质瘤U251细胞中livin基因的表达,研究livin基因沉默后对细胞生长和细胞凋亡的影响。方法:将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pSilencer2.0线性质粒以T4DNA连接酶连接,重组质粒经酶切鉴定后,用脂质体法转染胶质瘤U251细胞,通过RT-PCR、免疫印迹检测干扰效果。MTT法检测细胞生长的影响,流式细胞仪检测转染后胶质瘤U251细胞的凋亡变化。结果:酶切证实设计合成的DNA片段已正确插入载体。RT-PCR、免疫印迹检测实验表明:pSilencer2.0-liv1、pSilencer2.0-liv2重组载体均能有效地阻断胶质瘤U251细胞中livin基因的表达,使livin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.01),后者抑制效果更佳。转染后的U251细胞生长速度明显变慢。转染pSilencer2.0-liv2实验组细胞的凋亡增加了17.0%。结论:重组真核载体能有效抑制U251细胞的livin表达,抑制细胞的增殖,诱导细胞凋亡。

摘要：目的研究转染livin反义寡核苷酸（antisense 01igodeoxynucleotide，ASODN）对人胆管癌细胞株QBC939细胞livinmRNA及livin蛋白表达以及细胞增殖的影响。方法设计合成全硫代磷酸化修饰并5’端FITC荧光标记的livinASODN。用脂质体介导livin ASODN转染QBC939细胞，荧光显微镜观察24 h livin ASODN转染入细胞的情况，并计算转染率。MTT法检测I Lvin反义寡核苷酸对QBC939细胞增殖的抑制作用。RT-PCR和细胞免疫荧光化学分别检测转染后48 h livin mRNA表达及livin蛋白的变化。结果500mol／LASODN转染后24h可达到最佳的转染效果；转染后60h，能明显抑制胆管癌细胞的增殖。转染60h后，RT—PCR及细胞免疫荧光化学检测分别显示livin mRNA及livin蛋白表达水平明显低于对照组（P〈0．05）。结论脂质体介导转染livin ASODN能特异性地抑制QBC939细胞中的livin基因及livin蛋白表达，抑制胆管癌QBC939细胞的增殖，降低癌细胞活力。

摘要：目的:构建凋亡抑制蛋白livin真核表达载体pIRES2-AcGFP-livin。方法:设计合成扩增livinα和livinβ基因全长cDNA序列的特异性PCR引物,以食管鳞状细胞癌EC9706细胞总RNA为模板,进行RT-PCR,将获得的cDNA序列克隆入T载体,再用BglⅡ和EcoRⅠ双酶切,亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP,将重组质粒用脂质体包裹转染NIH3T3细胞,G418筛选得到稳定表达的细胞克隆,Western-blot检测转染细胞livinα和livinβ蛋白的表达情况。结果:构建了真核表达载体pIRES2-AcGFP-livinα和pIRES2-AcGFP-livinβ,测序分析证实插入序列正确;转染的NIH3T3细胞,可稳定表达livinα或livinβ蛋白。结论:成功构建livinα和livinβ真核表达载体。

摘要：目的构建凋亡抑制蛋白livin两种异构体(livinα和β)的原核细胞表达载体pET32a(+)-livinα和pET32a(+)-livinβ。方法设计合成扩增livin基因异构体全长cDNA序列的特异性PCR引物,以Hela细胞总RNA为模板,RT-PCR获得livin基因异构体全长cDNA序列,用限制性内切酶BamHⅠ和HandⅢ双酶切取所需目的片段,并插入原核表达载体pET32a(+)的多克隆位点,经酶切、PCR鉴定,并经过测序证实后,构建成为livin基因异构体表达载体(pET32a(+)-livinα、β)。将重组质粒转入表达菌株BL21,诱导表达收集菌液,超声碎菌,取其上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳。结果成功获得livinα和β全长cDNA序列,并克隆到原核表达载体pET32a(+)上;成功获得大小为55kd左右的融合蛋白。结论livin基因两种异构体原核表达载体的构建及其融合蛋白的制备,为进一步研究livin异构体功能及在肿瘤细胞中的抗凋亡效应奠定了基础。此蛋白也可用于进一步抗体制备、免疫鉴定和诊断等研究。