摘要：针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的m基因设计LAmP引物,对反应体系的条件优化并进行特异性及敏感性等试验。结果显示:该方法在60℃下恒温扩增60min,使PEDV的m基因得到了高效率特异性扩增。本试验方法特异性好,与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRSSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)及猪伪狂犬病病毒(PRV)等无交叉反应,同时也具有较好的灵敏性,最低检测分子拷贝数为1.0×102 copies/μL。反应结束后加入SYBR GreenⅠ在紫外灯下观察颜色变化,结果显示阳性扩增产物呈现绿色荧光。结果表明:该LAmP检测方法特异性强,灵敏度高,操作便捷,适于临床检测PEDV。

摘要：为建立检测禽流感病毒(AIV)且同时区分H3N2亚型AIV的方法,本研究根据H3、N2亚型AIV HA、NA基因及AIV最保守m基因的保守区域,设计并筛选出3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了AIV H3N2亚型和m基因三重RT-PCR的检测方法。对该法进行特异性及敏感性检测,并通过该三重RT-PCR方法对96份临床样品进行检测。结果显示,H3N2亚型AIV可扩增出3条特异性条带,其中518bp为AIV m基因、418bp为N2亚型AIV NA基因、271bp为H3亚型AIV HA基因;H3亚型和N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带,大小分别为518bp、271bp和518bp、418bp;其他亚型AIV可扩增出一条特异性条带,大小为518bp;常见禽病病原体均未扩增出任何条带。敏感性试验表明该法对H3N2亚型AIV的检测下限为100pg,96份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究所建立的AIV H3N2亚型和m基因三重RT-PCR为一种简便、快速、有效的检测方法。

摘要：为建立一种牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)快速简便的检测方法,本研究基于BRSV m基因保守区序列,设计特异性引物及探针,通过优化反应条件,建立用于BRSV检测的一步法实时荧光定量PCR,并验证了该方法的敏感性、特异性和重复性;同时利用建立的检测方法对采集的临床样本进行检测。结果表明:本研究所建立的BRSV荧光定量检测方法,其特异性好,仅对BRSV存在特异性扩增;敏感性高,最低可达10 copies/μL;稳定性好,组内变异系数和组间变异系数小。使用所建立的BRSV一步法实时荧光定量PCR对宁夏地区94份临床样品进行检测,阳性率为5.3%(5/94)。上述结果表明,本研究建立的检测方法可为BRSV的快速诊断提供有力的技术支持。

摘要：对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)陕西分离株SX-H09株膜蛋白(m)基因进行克隆和序列分析。根据GenBank发表的IBV基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增IBV m基因片段,并进行克隆、序列测定和分析。结果表明,SX-H09株m基因全长为678 bp,编码225个氨基酸。同源性比较可知,SX-H09株m基因与参考株m基因的核苷酸序列同源性为82.6%～99.6%,推导的氨基酸序列同源性为81.0%～99.6%。系统发育进化树表明,SX-H09株与参考株DY07和IBVSX7在同一个分支上,亲缘关系较近。

摘要：为建立H9N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR诊断技术,参考Gen Bank登录的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA、m基因序列,利用Primer Premier5.0软件设计3对可扩增HA、NA、m基因的特异性引物以及反转录引物。3对引物扩增的c DNA片段大小分别为1 742、1 410、1 027 bp。结果:通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了H9N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR诊断技术,与目的片段大小相符的片段,经测序均正确,且与其他常见禽病病原不存在交叉反应。该方法对HA基因的最低检出量为10-2μg/μL c DNA,对NA基因的最低检出量为10-2μg/μL c DNA,对m基因的最低检出量为10-3μg/μL c DNA。通过对30份H9N2阳性病毒液进行三重PCR,均可同时扩出HA、NA、m基因。结果表明,本试验建立了H9N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR诊断技术,为提高H9N2亚型禽流感病毒HA、NA、m基因序列分析的效率奠定基础。

摘要：根据GenBank发表的6型副黏病毒（APmV6）参考毒株（KF267717．1）m基因序列，利用Oligo7设计合成1对引物，以重组阳性质粒为标准品，建立了APmV-6SYBRGreen实时荧光定量PCR检测方法。结果显示，建立的检测方法经优化后，线性关系良好，标准曲线R^2=0．998，扩增效率107．322％。本方法敏感度高，特异性强，重复性好，最低检出拷贝数为2．78×10^2copies／μL，与NDV和APmV-4不发生特异性反应，比常规检测方法检出率高18％，可将其用于APmV-6的定量检测以及临床早期快速诊断。

摘要：利用DNASta软软件对GeneBank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)m基因序列进行分析,选择保守区域设计合成引物和探针,制备m基因重组质粒标准品,建立检测PEDV的Taqman荧光定量PCR方法,并验证其敏感性、特异性及重复性。结果表明:建立的定量标准曲线Ct值和模板起始拷贝数对数在10~8—10~1copies/μL有良好的线性关系,相关系数R^2为0.997,该方法可检测到初始模板中6.368 copies/μL的质粒DNA;应用该方法检测49份临床样品,阳性率达98%,比普通RT-PCR方法检测的阳性率高18%。研究表明,建立的PEDV Taqman荧光定量PCR检测方法具有较好的灵敏性、特异性和重复性,适用于临床样本中PEDV的快速检测,为PEDV的感染和增殖规律的研究奠定了基础。

摘要：研究旨在建立一种快速、高效、敏感、特异性强的方法以检测鸡传染性支气管炎病毒。通过比对鸡源传染性支气管炎病毒m基因的保守序列,设计并合成1对特异性引物和1条特异性Taqman探针;通过优化反应条件,建立检测鸡传染性支气管炎病毒的一步法实时定量RT-qPCR方法。以重组质粒为模板制作标准曲线,并对方法各项指标进行评价。结果显示,该曲线标准曲线方程为:y=-3.442logx+37.614,相关系数R^(2)=0.991;此方法灵敏度较高,最低可检测到1.0×10^(2)copies/μL,比普通PCR灵敏100倍;特异性强,与4种常见鸡病毒病无交叉反应,重复性试验组间以及组内变异系数均小于2%。研究表明,此方法操作简便,可直接用作粗提RNA的模板检测,灵敏度高、特异性强、重复性好,可应用于鸡传染性支气管炎病毒早期检测。

摘要：为建立一种快速、灵敏的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)早期痕量检测方法,该研究以PEDV的m基因为靶基因,设计了特异性引物和锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)-Taqman探针,经过条件优化,建立了基于LNA-Taqman探针的PEDV荧光定量PCR方法,并与常规Taqman探针法进行了比对。结果显示,所建立的PEDV的LNA-Taq-man探针荧光定量PCR方法最低检测限为3.2拷贝/微升,较常规Taqman探针法提高了10倍;与猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒等多种病原不存在交叉反应,特异性良好;批内和批间重复性结果的变异系数均小于1%,重复性较好。应用该方法对103份临床样品进行检测,结果显示,共检出PEDV阳性样品47份,阳性率45.63%,与常规Taqman探针法检测结果的阳性符合率为90.38%。本研究建立的基于LNA-Taqman探针的荧光定量PCR方法为PEDV的精准检测和流行病学调查提供了一种新的技术选择。

摘要：建立一种快速检测猪δ冠状病毒(PDCoV)的方法。根据GeneBank收录的PDCoV m基因序列,设计两对特异性引物和Taqman探针,对PDCoV Taqman荧光定量RT-PCR反应条件进行优化。Ct值与质粒模板之间呈现良好的线性关系,标准方程为y=-3.6421x+34.194,相关系数R 2=0.9992。荧光定量RT-PCR方法仅对PDCoV呈现特异性扩增,无交叉反应。敏感度试验结果显示,最低检出量为1.25×10^(1)copies/μL,灵敏度高。重复性试验结果显示,批内和批间测定均具有良好的重复性。Taqman荧光定量RT-PCR检测方法是一种可靠的快速检测PDCoV的方法。