摘要：目的:探讨shRNA沉默EIF4E基因对乳腺癌mda-mb-231细胞EIF4E及VEGF-C基因表达的影响。方法:制备针对EIF4E的三种小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),分别是siRNA1、siRNA2、siRNA3,筛选沉默最有效的siRNA,据此设计短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)寡核苷酸链,与真核表达载体pGPU6/GFP/Neo克隆连接,构建pGPU6/GFP/Neo-EIF4E重组质粒,经酶切鉴定后利用脂质体Lipofectamine^(TM) 2000将鉴定正确的重组质粒转染人乳腺癌mda-mb-231细胞,荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学法检测EIF4E及VEGF-C mRNA和蛋白表达情况。结果:RT-PCR结果显示siRNA1、siRNA2、siRNA3对乳腺癌mda-mb-231细胞EIF4E基因表达均有抑制作用,与空白对照组、阴性对照组、脂质体组比较差异显著(P<0.05),尤以siRNA3抑制率最高达71.2%。利用针对siRNA3合成的shRNA与质粒载体pGPU6/GFP/Neo克隆连接构建的重组质粒pGPU6/GFP/Neo-EIF4E,酶切鉴定表明构建成功,并稳定转染mda-mb-231细胞,平均转染效率为80%。RT-PCR、Western blot结果显示,稳定转染重组质粒后mda-mb-231细胞EIF4E及VEGF-C mRNA和蛋白表达均明显下降(P<0.05),抑制率分别为79.00%、67.90%(EIF4E)和77.01%、62.94%(VEGF-C)。免疫细胞化学染色法显示重组质粒组EIF4E及VEGF-C蛋白表达均受到明显抑制(P<0.05)。结论:靶向EIF4E的shRNA不仅能有效沉默乳腺癌细胞mda-mb-231中EIF4E的表达,且能抑制VEGF-C的表达,提示EIF4E可能参与诱导乳腺癌细胞VEGF-C的表达,而EIF4E-shRNA可能成为抑制乳腺癌淋巴管生成的一种新的有效手段。

摘要：目的:探讨适当敲除c-Met后对乳腺癌mda-mb-231细胞增殖的影响。方法:设计3条针对c-Met基因不同位点的短发夹RNA(shRNA)片段,将其连接到TA载体上,瞬时转染mda-mb-231细胞,采用RT-PCR、Western印迹检测c-Met mRNA及蛋白表达情况,挑选沉默效率最佳的shRNA。以scramble为阴性对照,mda-mb-231细胞为空白对照,挑选沉默效率最佳的TA-shRNA,并将其与pSD400慢病毒载体连接,利用293T细胞进行慢病毒组装,收集病毒液并感染mda-mb-231细胞,将嘌呤霉素与mda-mb-231细胞共培养,筛选稳定表达shRNA的细胞株。利用多西环素对稳定细胞系进行诱导,Western印迹检测稳定细胞系c-Met蛋白的表达量,MTT法检测敲低c-Met对稳定细胞系增殖的影响。结果:测序结果表明模板序列与设计序列正确,并筛选出沉默效率最高的shRNA为shRNA1,慢病毒包装后筛选出稳定细胞株,适当敲除mda-mb-231细胞c-Met基因后细胞的增殖明显低于对照组。结论:构建了针对c-Met基因可诱导shRNA的乳腺癌稳定细胞系,为探讨适当敲除c-Met基因后乳腺癌细胞对化疗、放疗敏感性检测奠定了基础。

摘要：目的探索乙酰肝素酶短发夹RNA(HPA-shRNA)对乳腺癌细胞的抗肿瘤作用。方法根据RNA干扰(interfering RNA,RNAi)序列设计原则,以乳腺癌HPA基因为靶基因,构建shRNA重组慢病毒表达载体,通过Western-blot检测HPA-shRNA的敲降作用;通过CCK8实验观察HPA-shRNA对乳腺癌mda-mb-231细胞生长增殖的影响;运用Transwell实验检测HPA-shRNA对乳腺癌mda-mb-231侵袭能力的影响。结果经测序分析证实HPA-shRNA1重组慢病毒载体构建成功;在mda-mb-231细胞内,HPA-shRNA1有效降低了HPA蛋白的表达水平(P<0.05);通过体外实验证明了HPA-shRNA1能够抑制乳腺癌mda-mb-231细胞的生长增殖及侵袭能力。结论 HPA-shRNA1重组慢病毒载体可有效抑制HPA在乳腺癌细胞中的表达,并且证实HPA-shRNA对mda-mb-231乳腺癌细胞具有良好的抗肿瘤作用。

摘要：目的构建原钙黏蛋白10(PCDH10)基因慢病毒表达载体并建立稳定过表达PCDH10的mda-mb-231细胞系。方法 2018年6—11月,根据PCDH10基因序列设计引物,应用PCR法扩增PCDH10全长片段,连接线性化的pLV-EF1α-GFP-Puro载体,获得pLV-PCDH10慢病毒重组质粒,测序正确后进行PCDH10基因慢病毒载体的包装及滴度测定。将重组质粒pLV-PCDH10转染mda-mb-231细胞,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分别检测mda-mb-231细胞中PCDH10的表达情况。结果测序结果证实成功构建慢病毒表达载体pLV-PCDH10,病毒滴度为5×10^8TU/mL;转染mda-mb-231细胞后,RT-PCR和Western blot结果显示PCDH10的m RNA和蛋白表达较对照组高表达。结论成功构建pLV-PCDH10慢病毒载体并建立稳定过表达PCDH10的mda-mb-231细胞系,为深入研究PCDH10基因在乳腺癌发生发展中的功能提供实验基础。

摘要：目的探讨定量沉默c-Met基因表达对人乳腺癌细胞mda-mb-231增殖、表阿霉素化疗敏感性的影响及其可能机制。方法设计3条针对c-Met基因不同位点短发夹RNA(shRNA)片段,瞬时转染mda-mb-231细胞,挑选出沉默效率最佳的shRNA,并设定scramble为阴性对照组,mda-mb-231细胞为空白对照组。将沉默效率最佳的TA-shRNA连接到PSD400慢病毒载体中进行病毒包装,收集病毒液并感染mda-mb-231细胞,利用嘌呤霉素筛选出稳定表达针对c-Met的shRNA细胞系(PSD400-c-Met-shRNA-mda-mb-231)及阴性对照组细胞(PSD400-scramble-mda-mb-231)。利用多西环素(DOX)诱导稳定细胞系,Western blot检测稳定细胞系c-Met蛋白表达水平,噻唑蓝(MTT)法检测敲低c-Met后对稳定细胞系增殖的影响。将诱导的稳定细胞系加入不同浓度表阿霉素,MTT法检测不同浓度表阿霉素作用对稳定细胞系存活率的改变,计算出药物半数抑制浓度(IC_(50));流式细胞技术检测细胞凋亡情况;Western blot检测凋亡相关蛋白多聚二磷酸腺苷(ADP)-核糖聚合酶(PARP)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表达。结果稳定细胞系PSD400-c-Met-shRNA-mda-mb-231经DOX诱导后细胞生长受到明显抑制,且加入不同浓度表阿霉素处理细胞后,细胞的存活率和IC_(50)均明显降低(P<0.05);同时G_(0)/G_(1)期细胞百分比明显升高,S期、G_(2)/M期细胞百分比明显降低(P<0.05)。Western blot检测凋亡相关蛋白PARP和caspase-3上调明显。结论定量沉默c-Met基因可以抑制mda-mb-231细胞的增殖,促进细胞凋亡,并提高了mda-mb-231细胞的化疗敏感性,靶向c-Met基因可能是治疗乳腺癌的有效方法。

摘要：目的构建人类DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)蛋白过表达慢病毒载体并建立乳腺癌细胞mda-mb-231稳定表达株。方法从乳腺癌细胞mda-mb-231中提取总RNA,逆转录出含DNMT3A的c DNA;以DNMT3A的c DNA为模板,根据其CDS序列设计含有EcoRⅠ和Bam HⅠ限制性内切酶位点的引物序列,采用PCR法扩增出带有双酶切位点的目的基因;采用双酶切法将目的片段连接到到慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Hyg中,获得重组的pLVX-FLAG-DNMT3A表达载体。重组的pLVX-FLAG-DNMT3A表达载体通过与包装质粒共转染293T细胞,获得携带FLAG-DNMT3A的重组慢病毒。以慢病毒感染mda-mb-231细胞,48 h后在培养基中加入1μg/μL的嘌呤霉素,筛选出稳定表达DNMT3A蛋白的细胞株,检测稳定株及野生型细胞DNMT3A蛋白及mRNA表达水平。结果构建的重组质粒经菌落PCR、重组质粒双酶切、质粒PCR验证及测序比对鉴定正确。用病毒感染mda-mb-231细胞,药物筛选后获得的过表达稳定株中,DNMT3A蛋白及mRNA表达水平分别为13.2±0.48、107.10±0.46,均高于野生型及空载对照。结论成功构建了DNMT3A基因慢病毒表达载体pLVX-FLAG-DNMT3A,并在mda-mb-231细胞中筛选出稳定表达DNMT3A的细胞株,为进一步探讨DNMT3A在乳腺癌中的作用提供了体外细胞系模型。

摘要：目的:应用规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas9)技术构建敲除BLM基因的人乳腺癌mda-mb-231细胞株。方法:根据CRISPR/Cas9技术靶点设计原则,在BLM基因的3号外显子设计2条靶向小向导RNA(sgRNA),利用PX459 V2质粒载体,构建PX459 V2-sgRNA重组质粒;将建构成功的重组质粒转染至mda-mb-231细胞中,通过嘌呤霉素筛选获得阳性克隆,使用Cruiser^(TM)核酸内切酶检测打靶效率,将打靶效率较高的阳性克隆进行单克隆培养,再利用免疫印迹法检测筛选出敲除BLM基因的mda-mb-231乳腺癌细胞株。结果:测序结果表明重组质粒构建成功,免疫印迹法显示敲除BLM基因后的mda-mb-231细胞中BLM蛋白明显降低,与空白对照组相比,BLM-KO组BLM表达水平明显低于对照组。结论:应用CRISPR/Cas9技术成功构建了BLM基因敲除的mda-mb-231细胞株。

摘要：目的:探索乳腺癌细胞mda-mb-231及MCF-7中CD44分子的表达水平差异及沉默CD44对乳腺癌细胞mda-mb-231增殖、侵袭和迁移的影响。方法:利用qRT-PCR及Western blot技术检测细胞中CD44基因表达水平;设计并合成CD44的siRNA片段(CD44-siRNA)转染乳腺癌细胞,利用qRT-PCR、Western blot技术检测细胞中CD44基因表达水平的变化;MTT检测mda-mb-231细胞增殖;Transwell侵袭实验检测mda-mb-231细胞的迁移与侵袭能力变化。结果:CD44在侵袭性乳腺癌细胞mda-mb-231中的表达高于非侵袭性乳腺癌细胞MCF-7,CD44-siRNA下调了mda-mb-231细胞中CD44 mRNA与蛋白水平的表达,并抑制了细胞的增殖和侵袭转移能力。结论:CD44-siRNA能够下调CD44的表达,并有效抑制乳腺癌细胞mda-mb-231的增殖及其侵袭迁移力。

摘要：目的：观察RNA干扰技术对乳腺癌mda—mb-231细胞VEGF—C表达的影响。方法：制备针对VEGF—C的三种小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），分别是siRNAa、siRNAb、siRNAc，筛选靶向基因最有效siRNA，据此设计短发夹RNA（shorthairpinRNA，shRNA）寡核苷酸链，构建pGenesil-1／VEGF—C重组质粒表达载体。利用脂质体将此质粒转染人乳腺癌mda—mb-231细胞，采用RT—PCR、免疫组织化学染色法和Westernblot方法检测VEGF—C的变化情况，利用QuantityOne软件对RT—PCR、Westernblot图像进行半定量分析，用Image—ProPlus6．0图像分析软件测量并分析免疫组织化学染色法结果。结果：RT—PCR结果显示siRNAa、b、c对mda—mb-231均有抑制作用，与空白对照组、脂质体组的差异性显著（P〈0．05），siRNAa抑制率最高（72．41％）。利用针对siRNAa合成的shRNA与质粒pGenesil-1构建表达载体pGenesil-1／VEGF—C，酶切鉴定及测序结果均表明构建成功。将其转染乳腺癌mda—mb-231细胞后，RT—PCR、免疫组织化学染色法和Westernblot方法检测均表明VEGF—C的表达明显受到抑制（P〈0．05）。结论：shRNARNA干扰技术可以有效沉默人乳腺癌细胞株mda—mb-231中VEGF—C的表达，提示该技术可能是抑制乳腺癌淋巴管生成的有效手段。

摘要：目的通过构建短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,转染乳腺癌mda-mb-231细胞,探讨慢病毒携带的shRNA对乳腺癌细胞乙酰肝素酶(HPA)基因表达的沉默作用。方法采用RNA干扰(RNAi)序列设计原则,以乳腺癌HPA基因为靶基因,将构建5对shRNA重组慢病毒载体,转染乳腺癌mda-mb-231细胞,通过Western印迹检测HPA-shRNA对mda-mb-231细胞HPA蛋白表达水平的影响;用CCK-8的方法检测HPA-shRNA对乳腺癌细胞的生长抑制作用及5-氟尿嘧啶(5-Fu)对乳腺癌细胞的杀伤作用,运用transwell实验检测HPA-shRNA对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。进一步,运用流式分析的方法检测HPA-shRNA对乳腺癌细胞周期的影响。建立小鼠转移瘤模型,检测HPA-shRNA在体内对乳腺癌细胞的生长抑制作用。结果成功构建HPA-shRNA重组慢病毒载体。在体外,实验组HPA-shRNA1组、HPA-shRNA3组、HPA-shRNA4组有效沉默了人乳腺癌mda-mb-231细胞HPA的表达,HPA蛋白表达明显降低(P<0.05)。HPA-shRNA1对乳腺癌细胞的生长具有良好的抑制作用,HPA-shRNA1能够增加乳腺癌细胞对5-Fu的敏感性。此外,HPA-shRNA1能够诱导乳腺癌细胞在S期发生细胞周期阻滞。在体内,HPA-shRNA1组HPA基因mRNA相对表达量明显低于阴性对照组(P<0.05),HPA-shRNA1能够沉默乳腺癌移植瘤HPA mRNA表达。在体内HPA-shRNA1同样能够抑制乳腺癌细胞生长。结论 HPA-shRNA重组慢病毒载体可有效抑制乳腺癌HPA基因的表达,进而发挥良好的抗肿瘤作用。