摘要：应用Crispr/Cas9基因编辑技术敲除mdck细胞中的Annexin A2基因,并验证其是否为ε毒素在mdck细胞表面的受体。根据Crispr/Cas9靶点设计原则设计靶点,构建PALentiCRISPR v2重组质粒。借助Crispr/Cas9技术,将构建好的质粒转染至mdck细胞中,用嘌呤霉素筛选敲除Annexin A2蛋白的mdck细胞株,并通过测序和Western blot验证敲除效果。通过细胞毒性试验验证mdck细胞膜表面的Annexin A2蛋白是否为ε毒素的受体蛋白。测序结果和Western blot结果表明,通过Crispr/Cas9技术成功敲除了mdck细胞的Annexin A2基因,但细胞毒性试验结果表明,敲除Annexin A2基因并不能减弱ε毒素对mdck细胞的毒性。结果表明,Annexin A2蛋白不是ε毒素在mdck细胞表面的受体,研究结果为今后mdck细胞其他蛋白的敲除提供了试验方法,构建的Annexin A2基因敲除的mdck细胞也为Annexin A2蛋白引起的其他疾病的研究奠定了基础。

摘要：利用CRISPR/Cas9技术构建RIG-I基因敲除mdck细胞株,并验证其生物学功能。试验设计并构建了2个靶向RIG-I基因的导向RNA(sgRNA)表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染mdck细胞,采用PAGE胶基因型检测、定点测序和Western blot筛选细胞株;通过荧光定量PCR检测H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染后MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平和病毒基因拷贝数,测定TCID50。结果表明:获得两株稳定敲除RIG-I基因的mdck细胞(mdck-RIG-I-/-),Western blot检测RIG-I蛋白不表达;荧光定量PCR结果显示病毒感染后mdck-RIG-I-/-的MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平显著降低,表明RIG-I基因敲除后RIG-I-Ⅰ型干扰素信号通路受阻;病毒基因拷贝数、TCID50测定结果显示,差异最高可分别达到野生型mdck的2.16倍、3.19倍,表明RIG-I基因敲除后流感病毒复制增加。该研究利用CRISPR/Cas9技术建立了敲除RIG-I基因流感病毒mdck细胞株,为研究RIG-I天然免疫应答机制奠定基础;该技术方法和策略也为流感疫苗生产及产业更新换代提供候选细胞株。

摘要：本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,首先靶向犬全基因组设计合成转录sgRNA的DNA文库,并将DNA文库全部克隆于lentiCRISPR v2慢病毒转移载体上,高通量测序结果显示文库覆盖度高、均一性良好。将质粒文库和慢病毒包装系统质粒共转染293T细胞,收取含慢病毒样病毒的上清液感染mdck细胞,在最适浓度嘌呤霉素筛选下,收集嘌呤霉素抗性细胞,冻存于-80℃,提取一部分细胞的基因组,通过PCR扩增转录sgRNA的DNA,将PCR产物插入到T载体后,挑取单克隆菌落,测序表明细胞文库中转录的sgRNA具有较好的覆盖度。本实验成功构建了犬全基因组范围转录sgRNA的质粒文库,并成功构建了mdck细胞全基因组范围的基因编辑细胞库,该文库可作为后续筛选病毒复制关键宿主因子的细胞平台。

摘要：目的:构建稳定表达人SidT2基因的BHK及mdck细胞系,探讨SidT2基因过表达与细胞转运双链RNA(dsRNA)能力的关系。方法:根据人SidT2基因序列设计引物,克隆其编码区序列,经双酶切后与pEGFP-N3载体连接,构建其真核表达载体,分别瞬时转染BHK及mdck细胞,并使用G418筛选稳定表达细胞系;在此基础上,体外转录合成绿色荧光蛋白(GFP)dsRNA,以GFP基因为报告基因,进一步分析过表达人SidT2基因对BHK及mdck细胞转运dsRNA能力的影响。结果:经基因克隆、酶切、连接后,构建了人SidT2基因真核表达载体pEGFP-SidT2;经瞬时转染及G418筛选,获得稳定过表达人SidT2基因的BHK及mdck细胞系,实时荧光定量RT-PCR分析表明,其SidT2基因转录水平分别提高71、64.5倍;稳定表达SidT2基因后,在培养液中添加GFP dsRNA,GFP荧光强度较对照细胞分别降低88.1%、73.7%,表明稳定表达SidT2基因的BHK、mdck细胞转运dsRNA的能力显著增强。结论:构建了稳定表达人SidT2基因的BHK及mdck细胞系,SidT2基因过表达可显著提高外源性dsRNA的转运能力。