摘要：旨在初步探究猪m^(6)A甲基化酶mettl3基因表达水平与脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)诱导猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)损伤的关系。本研究构建了稳定干扰mettl3基因表达水平的IPEC-J2细胞系,用1μg3;mL^(-1) DON诱导mettl3干扰组和对照组猪肠上皮细胞48 h,通过实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因、免疫相关基因、抗氧化酶相关基因表达水平,同时测定细胞增殖活性、细胞周期、细胞凋亡以及活性氧(ROS)水平。结果显示,与对照组相比,干扰组免疫相关基因TNF-α、IL-6、IL^(-1)2的表达水平产生了显著变化(P<0.05),凋亡相关基因Bax、Caspase3、Caspase9表达量均显著下降(P<0.05),抗氧化酶相关基因GPXs、CuZn-SOD、CAT表达量显著上升(P<0.05);细胞增殖活性显著提高,细胞总凋亡率显著降低(P<0.05),ROS水平极显著降低(P<0.01)。本研究结果表明,mettl3基因表达水平降低能一定程度地帮助IPEC-J2细胞抵抗因DON诱发的细胞凋亡和炎症。mettl3表达下调有利于缓解DON对于细胞损伤产生的一系列炎症反应,为今后细致研究RNA甲基化修饰在仔猪抵抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇损害调控中的作用机制提供了理论基础。

摘要：【目的】探究RNA甲基化转移酶样3(methyltransferase-like 3,mettl3)对牛骨骼肌卫星细胞(bovine skeletal muscle satellite cells,BSMSCs)增殖和成肌分化的影响。【方法】利用体外诱导BSMSCs分化模型模拟牛骨骼肌生长发育过程,采用实时荧光定量PCR技术和蛋白质免疫印迹技术(Western blotting)检测mettl3在BSMSCs分化前后mRNA和蛋白表达水平的差异。设计合成mettl3干扰RNA(si-mettl3),且构建mettl3的过表达载体pcDNA3.1-mettl3,分别转染至BSMSCs中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测转染效果和BSMSCs增殖标志因子盒转录家族成员7(paired box 7,Pax7)的表达情况,EdU检测细胞增殖情况。将转染si-mettl3和pcDNA3.1-mettl3的BSMSCs进行体外诱导分化,通过光学显微镜观察BSMSCs进入分化期的细胞形态,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测BSMSCs分化标志因子肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)、肌细胞生成素(myogenin,MyoG)的表达情况。通过比色法检测干扰或过表达mettl3后,BSMSCs不同时期的m 6 A RNA甲基化水平。【结果】BSMSCs分化后mettl3蛋白表达水平极显著高于增殖期(P0.05),EdU阳性细胞率与对照组相比均无显著差异(P>0.05);干扰mettl3后,细胞肌管数量明显增多,肌管直径明显增大,MyHC的mRNA和蛋白表达水平极显著升高(P<0.01),MyoG的蛋白表达水平极显著升高(P<0.01),并且BSMSCs增殖和分化期的m 6 A RNA甲基化水平均极显著下调(P<0.01);过表达mettl3后,细胞肌管数量明显减少,肌管直径明显变小,MyHC的mRNA和蛋白表达水平极显著降低(P<0.01),MyoG的蛋白表达水平极显著降低(P<0.01),并且BSMSCs增殖和分化期的m 6 A RNA甲基化水平均极显著上升(P<0.01)。【结论】mettl3对BSMSCs的增殖过程没有显著影响,但对BSMSCs的成肌分化过程具有调控作用,并影响BSMSCs的m 6 A RNA甲基化水平。干扰mettl3可以促进BSMSCs的成肌分化进程,降低BSMSCs的m 6 A RNA甲基化水平;而过表达mettl3会抑制BSMSCs的分化,提高BSMSCs的m 6 A RNA甲基化水平。试验结果为进一步探明mettl3在牛肌肉发育中的调控机制奠定了基础。

摘要：m^6A是真核生物m RNA中重要的转录后修饰,mettl3作为m^6A甲基转移酶复合物中的重要组分,在细胞重编程、胚胎干细胞和诱导多能干细胞的干性维持、胚胎发育等过程中发挥重要作用。为了揭示猪mettl3的表达模式,对不同物种mettl3蛋白序列进行了比对,用RT-PCR检测了mettl3基因在不同猪组织和细胞中的表达情况,并确认了mettl3的细胞核定位。为了研究mettl3对猪干细胞多能基因表达的调控作用,克隆了猪mettl3编码区序列,设计了mettl3干扰片段,并构建了相应的过表达和沉默载体。发现干扰mettl3的表达后,猪多能干细胞出现类似na?ve状态的细胞克隆,NANOG、OCT4和LIN28A表达水平显著升高。在猪多能干细胞培养基中添加m^6A甲基化抑制剂环亮氨酸培养细胞48 h后,试验结果与干扰mettl3表达的结果一致。本研究为优化猪多能干细胞的培养体系提供了新的方向和依据。