摘要：目的 用慢病毒载体构建干扰肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)表达的类风湿关节炎(RA)患者滑膜细胞株mh7a细胞稳转株,研究TNF-α-TRAF2信号在mh7a异常增殖的作用。方法 根据人TRAF2的基因序列和shRNA序列设计原则,设计并合成3对TRAF2-shRNA干扰序列,通过PCR对引物进行退火,通过双酶切PLKO.1-puro获得线性载体,将线性化载体与退火后引物通过Solution I连接,连接产物导入感受态细胞,涂板,挑取阳性菌落进行测序。构建3种不同的PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒重组质粒,借助慢病毒包装质粒对对数生长期的HEK 293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒液感染mh7a细胞,同时使用嘌呤霉素对TRAF2低表达的mh7a稳转株进行筛选。使用CCK-8法、Western blot、qPCR检测mh7a中肿瘤坏死因子TNF-α诱导TRAF2低表达的mh7a增殖功能及下游信号TRAF2、P65蛋白表达和mRNA水平。结果 成功构建了PLKO.1-TRAF2-shRNA(1)、PLKO.1-TRAF2-shRNA(2)和PLKO.1-TRAF2-shRNA(3)慢病毒载体质粒和对照组慢病毒载体质粒PLKO.1-puro,将3个TRAF2-shRNA慢病毒载体质粒和对照组慢病毒载体质粒PLKO.1-puro分别与慢病毒包装质粒导入HEK 293T获得病毒液,将病毒液感染mh7a细胞后,经嘌呤霉素(2.00μg/ml)筛选,2 d得到mh7a稳转株;qPCR和Western blot结果显示,PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) mh7a细胞稳转株中TRAF2 mRNA和蛋白的表达较阴性对照组明显下降;CCK-8和Western blot结果表明,mh7a中TRAF2敲低后,TNF-α诱导的TRAF2低表达的mh7a细胞增殖和P65的磷酸化水平明显下降。结论 成功构建了PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) mh7a细胞稳转株,研究TNF-α-TRAF2信号活化介导RA滑膜细胞异常增殖中的作用。

摘要：目的:优化鹿筋蛋白提取工艺,探究其对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(mh7a)增殖及炎症因子分泌的影响。方法:以料液比、提取温度、提取时间为自变量,鹿筋蛋白含量为因变量,进行单因素实验,结合Box-Behnken试验设计,获得鹿筋蛋白最佳提取工艺。采用60 ng/mL肿瘤坏死因子-α(TNF-α)体外诱导mh7a细胞,MTT法测定不同浓度的(25、50、100、200μg/mL)鹿筋蛋白对mh7a细胞增殖抑制活性的影响;酶联免疫法测定细胞上清液中NO(一氧化氮)、白细胞介素-6(IL-6)、TNF-α含量。结果:鹿筋蛋白最佳提取条件为料液比1∶21 g/mL、提取温度88℃、提取时间8.6 h,此条件下测得鹿筋蛋白含量为12.53%。体外活性实验结果表明,与模型组比较,不同浓度(25、50、100、200μg/mL)的鹿筋蛋白均可显著(P<0.05)抑制mh7a细胞的增殖和NO、IL-6、TNF-α的释放(P<0.05),模型组的NO、IL-6、TNF-α释放量分别为:4.07、21.95、16.31 pg/mL,在100μg/mL质量浓度下,鹿筋蛋白对上述三种炎症因子释放的抑制作用最显著(P<0.05),其释放量分别为:1.60、13.60、7.29 pg/mL。结论:鹿筋蛋白通过抑制TNF-α诱导的mh7a细胞增殖,同时减少炎症因子NO、IL-6、TNF-α的释放,发挥其抗类风湿性关节炎的作用。本研究为研究鹿筋蛋白的制备工艺提供参考,并证明鹿筋蛋白具有较好的体外抗类风湿性关节炎活性。