摘要：目的建立TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测嗜肺军团菌技术，为临床和环境样品检测嗜肺军团菌提供可实用工具。方法在对嗜肺军团菌mip序列进行分析、比较基础上，设计一对特异性引物和TaqMan—MGB探针，通过实时荧光PCR反应条件和反应体系的优化，实现对嗜肺军团菌的快速检测；用克隆到pMD-19T载体上的嗜肺军团菌mip基因阳参片段和不同菌株验证方法的敏感性和特异性。结果当用热裂解法提取DNA，25μl的反应体系中包括上、下游引物（20μmoL／L）各0．6μl，探针（20μmol／L）0．4μl，模板DNA6．0μl，反应条件为预变95℃20s，变性95℃10s，退火50℃40s，40个循环时，TaqMan—MGB探针实时荧光PCR技术对嗜肺军团菌mip基因阳参片段最低检测浓度为0．71拷贝μl，其循环阈值（Ct值）与模板浓度具有极好的对应关系（r=0．999）；1株嗜肺军团菌标准株、12株嗜肺军团菌分离株的Ct值在13．23—16．04之间，而包括金黄葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺菌共计76株其他菌PCR Ct值均大于30；整个检测过程仅需1．5h。结论TaqMan-MGB探针的嗜肺军团菌实时荧光PCR检测方法具有特异性和敏感性、易操作、结果准确可靠等优点，可用于嗜肺军团菌检测。

摘要：目的建立同时检测军团菌属和嗜肺军团菌的双重荧光定量PCR方法。方法利用军团菌16SrDNA和rnip基因的特异性序列设计引物和MGB探针，两条探针5’端分别标记FAM和HEX，3’端标记MGB。优化了荧光定量PCR反应条件和反应体系，并对军团菌、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其它细菌进行检测，验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果该方法所检测菌株中军团茵属结果均为16SrDNA阳性（LP12、LP13除外）；嗜肺军团菌均为mip阳性，非嗜肺军团菌属除***外均为阴性；而非军团菌菌株16SrDNA和mip检测结果均为阴性。检测灵敏度达10个拷贝／反应；重复性实验中，变异系数为0．2％～O．6％；从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右。结论本文建立的TaqMan-MGB双重探针荧光定量PCR是一种定量检测军团菌的特异、快速、敏感的方法，可区分嗜肺与非嗜肺军团菌属，该方法的建立将有益于今后开展对外环境污染源进行初步卫生学调查与评估，以及应急临床标本的快速定量检测。

摘要：目的建立一种特异、快速、敏感,同时能区分嗜肺和非嗜肺军团菌的荧光定量PCR方法,用于检测临床和环境样品。方法利用军团菌属特异性23S rRNA基因和嗜肺军团菌种mip基因的保守序列,设计引物和TaqMan探针。提取嗜肺军团菌标准菌株(LP1)DNA,分别构建2个含有目的基因的标准质粒作为阳性模板。优化荧光PCR反应条件和反应体系,对方法的特异性、敏感性、重复性进行评价。并对环境水样及80份临床痰样进行检测。结果该方法检测灵敏度达10标准质粒拷贝数/反应,具有高度特异性、稳定性。整个过程约需2 h。对35份环境水样进行检测,检出3株嗜肺军团菌和3株非嗜肺军团菌,所有水样经传统分离培养法和普通PCR法检测均显示为阴性。对临床80份随机痰液标本进行检测,2份嗜肺军团菌阳性。结论 TaqMan探针荧光定量PCR双管检测是一种可同时区分嗜肺与非嗜肺军团菌的特异、敏感、稳定的方法,可用于基层医院对环境标本及临床痰样的检测。

摘要：目的建立特异、快速、敏感的TaqMan探针荧光定量PCR方法,用于检测嗜肺军团菌mip基因。方法嗜肺军团菌及其他军团菌DNA模板来自中国疾病预防控制中心呼吸道室,嗜肺军团菌地方株及其他对照株由本中心菌种室供给。利用嗜肺军团菌mip基因保守序列设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量PCR反应条件和反应体系进行优化,并对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性等。结果该方法在检测多株嗜肺军团菌时,均出现阳性信号,而对非嗜肺军团菌和其他细菌则未有阳性扩增结果出现。检测灵敏度达10个拷贝/反应,从菌株核酸的提取至检测完成仅需2 h左右,可减少常规PCR操作的污染机会。结论TaqMan荧光定量PCR方法可定量检测嗜肺军团菌,具有特异性高、快速、敏感等特点,适于外环境污染源状况的调查及应急事件的快速定量检测。

摘要：目的　建立检测mip基因的PCR方法,以检出环境水体中的嗜肺军团菌。　方法　采用Godkey软件设计引物,制备菌种模块,对模拟和环境水样进行处理,然后作PCR扩增及其产物检测。　结果　该方法检测军团菌的灵敏度为5 .8×10 2 cfu/ml,6株标准军团菌均扩增出65 0bp的条带,4株非嗜肺军团菌和4株非军团菌无条带出现;检测71份环境水样,5份阳性,阳性率为7.0 %。　结论　该方法快速、灵敏、特异。

摘要：目的建立检测环境水体中嗜肺军团菌聚合酶链(PCR)法。方法以嗜肺军团菌特异性保守基因mip为靶基因,采用Godkex软件设计引物,聚合酶链反应测定。结果该方法检测军团菌的灵敏度为5.8×102cfu/ml,6株标准军团菌均扩增出996 bp的条带,4株非嗜肺军团菌和4株非军团菌无条带出现;检测71份环境水样,5份阳性,阳性率为7.0%。结论该方法快速、灵敏、特异,是检测水体中嗜肺军团菌的有效方法。

摘要：目的:建立嗜肺军团菌mip基因荧光定量PCR检测方法。方法:利用Primer Express软件设计特异性引物和探针,对质粒标准品、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他菌株进行检测,验证方法的特异性、敏感性和重复性,最后采集环境样本进行检测。结果:该方法特异性好,嗜肺军团菌呈现阳性结果,而非嗜肺军团菌及其他菌株均为阴性结果。检测灵敏度达293copies/μl;重复性较好,Ct值变异系数较小;检测的12份环境样本中5份阳性。结论:该方法快速且具有较好的特异性、敏感性、重复性,适于外环境嗜肺军团菌污染调查及应急事件的快速检测。

摘要：目的建立一种嗜肺军团菌的核酸等温扩增试纸条及pH显色快速检测方法,从而实现对空调冷却水样中嗜肺军团菌的快速现场检测。方法基于嗜肺军团菌特异性mip基因设计引物,建立环介导等温扩增体系,并结合反应产物横向流动试纸条和pH显色检测技术,进而验证方法的灵敏性、特异性,并对浙江省不同地区的中央空调冷却水水样进行检测。结果环介导的等温扩增试纸条及pH显色检测方法灵敏度可高达3 cfu/μl,特异性好,且检测时间仅需40 min左右。检测的灵敏度与荧光定量PCR的方法基本一致,对外环境空调冷却水的检测阳性率与荧光定量也相符。结论建立的嗜肺军团菌试纸条与pH显色快速检测方法,灵敏度高,特异性好,适合现场快速检测。

摘要：目的:建立针对嗜肺军团菌mip基因的实时荧光定量TaqMan PCR检测方法,并进行自来水和空调冷却水模拟标本的检测评价。方法:根据嗜肺军团菌mip基因的特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立嗜肺军团菌的实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法,对方法进行灵敏度及特异性评价,并对自来水和空调冷却水模拟标本中的嗜肺军团菌进行检测。结果:建立的方法对嗜肺军团菌的检测具有高度特异性,与3种非嗜肺军团菌和6种其他呼吸道病原均没有交叉反应;基因组DNA的检测灵敏度为1.6 pg/μL,模拟自来水和空调冷却水标本的检测灵敏度为10CFU/mL。结论:建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,适于嗜肺军团菌的日常监测和暴发疫情的应急诊断。

摘要：目的建立嗜肺军团菌特异、快速检测方法,探讨南京地区公共场所环境水样嗜肺军团菌污染状况。方法根据嗜肺军团菌的mip基因保守序列设计引物和探针,通过对嗜肺军团菌标准株ATCC33152、嗜肺军团菌南京分离株及大肠埃希菌ATCC25922、鼠伤寒沙门菌ATCC14028、福氏2a志贺菌ATCC12022进行检测,验证该方法的特异性。并应用该法对南京地区某商场、宾馆、办公楼、医院共计13家的中央空调系统的冷却水、淋浴水和景观水共计88份环境水样进行了PCR检测及军团菌的分离培养。结果该法对嗜肺军团菌有特异性扩增曲线,而对其他细菌无阳性扩增曲线。88份水样中荧光定量PCR方法检测出28份阳性,阳性率为31.8%;传统培养方法分离出17株军团菌,分离率为19.3%。结论本文建立的荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性,可用于环境水中军团菌污染状况调查。南京地区中央空调冷却水中检出率最高,存在发生军团菌病的可能,应引起足够重视。