摘要：【目的】构建犬细小病毒(CPV)VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础。【方法】参考GenBank中发表的CDV n蛋白基因序列设计引物,采用RT-PCR方法从疑似犬瘟热病犬全血样品中扩增CDV n蛋白基因,将其克隆至真核表达载体pcDnA3.1(+)。经测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达CDV n蛋白基因,8 h取其肝脏提取总RnA,进行RT-PCR方法扩增。【结果】在病犬的全血样品中扩增得到1 572 bp的CDV n蛋白基因片段,并构建了真核表达质粒pcDnA3.1(+)-CDV n,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RnA中可扩增到目的条带。【结论】构建了犬瘟热病毒n蛋白基因真核表达质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达。

摘要：参考GenBank中发表的CDVn蛋白基因序列，用Oligo6．0软件设计一对特异性引物，从患犬瘟热的犬全血样品中提取总RnA，经RT—PCR扩增得到1572bp的基因片段，将其插入pMD18-T克隆载体中构建了pMD18-CDVn重组质粒，将其转入到大肠杆菌DH5a中，进行鉴定、测序。将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-2连接构建了pGEX-4T-2-CDVn重组质粒，转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，进行鉴定、测序、IPTG诱导表达。序列分析表明克隆的CDVn蛋白基因从起始密码子ATG开始到终止密码子TAA结束全长为1572个核苷酸，与GenBank中发表的CDVn蛋白基因序列相比同源率达到93．9％～99．1％。Western-blotting分析显示表达产物为84kDa的融合蛋白，可被犬瘟热抗血清所识别，具有良好的抗原性。

摘要：对SARS病毒核蛋白(n)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对SARS病毒n蛋白基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-n,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp,编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比,核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100%。将pGEM-n双酶切,回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中,构建了重组质粒pET-n;将其转化表达菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明:重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Western-blotting证实,重组n蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组n蛋白表达量约占菌体蛋白的43%。

摘要：为建立一种检测狂犬病病毒的方法,根据Gen Bank已公布的狂犬病病毒核蛋白n基因序列,设计并合成一对特异性的引物,以兽用疫苗株HEP-Flury为阳性毒株建立了RT-PCR检测方法。对建立的RT-PCR方法做灵敏度、特异性、重复性及稳定性试验,结果显示该方法的灵敏度可以达到20 FFU/m L,可以将狂犬病病毒与犬瘟热病毒和犬细小病毒区别开来。该方法重复性好,稳定可靠。

摘要：为了获得小反刍兽疫病毒特异性抗原n蛋白,用于血清中抗小反刍兽疫病毒抗体检测方法的建立,根据Gen Bank中已发表的小反刍兽疫病毒(PPRV)n蛋白核苷酸序列,设计引物,扩增n基因。扩增片段通过ndeⅠ和HindⅢ酶切位点插入表达载体p ColdⅠ。重组蛋白通过p ColdⅠ载体转化,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了原核表达,经SDS-PAGE和Western Blotting检测表明,表达产物为58 k D的融合蛋白,可被PPRV感染动物血清识别,重组蛋白具有良好的反应原性。用纯化的重组n蛋白作为包被抗原,建立了检测PPRV血清的间接ELISA方法,与国外标准ELISA试剂盒的符合率达98.3%,为建立快速检测小反刍兽疫病毒抗体的检测方法奠定了基础。

摘要：根据时代需要,利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplifcation,LAMP)对新冠病毒进行快速检测,以研发出新冠病毒检测试剂盒。通过nCBI公布的新冠基因组序列分析,获得新冠病毒特异性n蛋白基因的序列;根据该序列信息,在线设计的几对环介导等温扩增引物以供筛选,并利用新冠病毒全基因的反转录质粒,同时通过大量的实验尝试,得到较为稳定的环介导等温扩增体系,再加入具有逆转录活性的Bst3.0 DnA聚合酶,使体系可扩增RnA模板,最后通过加入适量染料,完成反应结果的可视化。通过不断的实验优化,得到了较为稳定的扩增体系如下:2×Lamp Master Mix 12.5μL,Bst 3.0 DnA聚合酶0.5μL,内引物FIP、BIP(10μM)各2μL、外引物F3、B3(10μM)各0.5μL、模板1μL、dd H_2O 7μL,该体系在65℃下水浴加热1 h即可,同时在体系中加入MnCl_(2)溶液(15 m M)1μL、钙黄绿素(500μM)3μL,使反应结果肉眼可断,加入模板的体系变为绿色,而未加模板的体系为棕黄色。结论:本实验研究的可视化LAMP检测新冠病毒的方法可用于对广大人民群众进行新冠病毒核酸检测。