摘要：提高对丙型肝炎患者实验室检测的灵敏度和特异性,对相关人群进行筛查和早期诊断,是控制丙型肝炎病毒(HCV)流行与传播的有效措施。为了建立更为可靠的HCV诊断方法,通过采用PCR方法从J6/JFH12a型病毒中克隆出HCV ns3基因片段,将其连接到p ET-28a载体上,重组载体p ET-28a-ns3转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,以10%SDS-PAGE进行鉴定,获得表达的ns3重组蛋白分子量为72 k Da。将纯化的ns3蛋白免疫BALB/c小鼠,第4次免疫后采集血液并分离血清进行抗体活性鉴定,小鼠抗体效价为1∶256 000。进一步的Western blotting和间接免疫荧光结果显示,以重组ns3蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体可以很好地识别HCV感染Huh7.5.1细胞中的ns3蛋白,为下一步开展单克隆抗体制备和检测试剂盒研制工作奠定了基础。

摘要：以经典毒株C株的基因组为模板,测序后对ns3蛋白的二级结构进行分析,并对抗原表位进行预测,结果表明ns3的二级结构非常丰富并且存在丰富的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。截获3个不同的基因区域a、b和c,并设计相应的引物,分别扩增出约645、609和615 bp的靶基因,分别用pET-28a表达载体进行重组后,获得pET-28a-ns3a、pET-28a-ns3b与pET-28a-ns3c,用表达菌株BL21(DE3)进行表达,b段表达较高,可溶性表达较好,纯化后,可获得重组蛋白CSFV-His-ns3b, SDS-PAGE验证表达的重组蛋白大小约为27 kD,Western-Blot证实其具有良好的免疫原性,并且通过ELISA测得蛋白浓度约5 mg/mL,表明该蛋白特异性很强,可用于猪瘟诊断试剂盒的开发应用。

摘要：目的用配基指数富集的系统进化技术(SELEX)技术筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白ns3的DNA适配子。方法构建随机ss DNA文库,两端为固定序列,中间为39 nt的随机序列,总长度为85 nt,将ns3蛋白包被在96孔板上,ss DNA与ns3蛋白进行亲和反应,洗去未结合的ss DNA,洗脱回收与ns3蛋白结合的DNA,PCR扩增后,磁珠法分离成单链。重复以上筛选步骤,直至筛选出高特异性和亲和力的核酸适配子。将核酸适配子连接质粒载体克隆转入大肠杆菌,挑选阳性克隆提取质粒外送到公司进行测序。结果通过8轮筛选,成功筛选出DNA适配子,并获得其中6条克隆的DNA一级序列。6条适配子序列长度相同,均为85 nt,两端固定序列与设计相符,中间为随机序列,随机序列无共同保守系列。所有寡核苷酸适配子的二级结构以茎环和凸环为主。结论以ns3蛋白作为药物研究的靶点,结合SELEX筛选技术研究其核酸适配子,具有巨大的潜力和研究价值。