摘要：[目的]本试验旨在制备特异性鼠抗猪瘟病毒(CSFV)非结构蛋白ns3和ns5b的多克隆抗体。[方法]根据CSFV ns5b基因序列设计1对特异性引物,以CSFV石门株为模板PCR扩增ns5b基因,同时根据大肠杆菌对密码子的偏嗜性优化了ns3密码子,并将ns3和ns5b基因分别克隆至原核表达载体p Cold I,转化至大肠杆菌Rossetta 2(R2),经0. 1mmol·L-1IPTG诱导后进行融合蛋白的表达和纯化,常规免疫bALb/c小鼠制备抗血清。应用Western blot和间接免疫荧光技术鉴定了多克隆抗体的特异性。[结果]Western blot结果显示,该抗血清不仅能识别原核和真核表达的ns3和ns5b蛋白,也能识别细胞中感染的CSFV并产生特异性条带;间接免疫荧光检测结果表明,2种抗血清除均能与胞浆中的CSFV粒子发生反应外,也能识别宿主细胞中真核表达的ns3和ns5b蛋白。[结论]本试验成功表达了ns3和ns5b,且用其制备的抗血清具有生物学功能,为深入探究猪瘟病毒致病机制奠定了基础。

摘要：为构建HCV截短型ns5bΔ21基因的原核表达质粒;在大肠杆菌中表达ns5b蛋白并纯化,制备其抗体。运用软件设计引物,以bb7复制子为模板PCR扩增ns5bΔ21基因;克隆入原核表达载体pRSETA。将重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21转化bL21大肠杆菌,并诱导表达、可溶性分析及纯化;用纯化的ns5b蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果酶切鉴定和序列测定表明成功的构建了重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21;其经IPTG诱导后行SDS-PAGE可见新生表达条带,Western-blot证实了其特异性和抗原性良好;利用镍离子亲和层析和电洗脱方法获得了纯化ns5b蛋白;用纯化蛋白免疫小鼠制备出了多价抗血清。说明表达和纯化的截短型HCV ns5b RNA聚合酶可用于下一步筛选单链抗体。

摘要：目的:构建可受Tet-on和Cre/loxP系统双调控的HCV ns5b真核表达载体,为建立可严格调控HCVns5b蛋白表达的转基因小鼠奠定基础。方法:以真核表达载体pbI-3为载体构建骨架,在其启动子下游依次插入luc报告基因、bGHpA和ns5b基因片段,并分别在luc报告基因上游和bGHpA尾下游引入一个loxP位点。结果:成功构建了可受Tet-on和Cre/loxP系统双调控的HCV ns5b真核表达载体pbI-3/luc-bGHpA-ns5b。结论:pbI-3/luc-bGHpA-ns5b真核表达载体的成功构建为可严格调控HCV ns5b蛋白表达转基因小鼠的建立打下了良好的基础。

摘要：目的改进达萨布韦的合成工艺。方法以邻叔丁基苯酚为原料,经卤代、甲基化、Ullmann偶联反应得到关键中间体1-(3-叔丁基-5-碘-4-甲氧基苯基)嘧啶-2,4-(1H,3H)-二酮(5);以6-溴-2-萘甲酸甲酯为起始原料,经水解、Curtis重排、磺酰化、取代反应得到中间体N-(6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂戊硼烷-2-基)萘-2-基)甲烷磺胺(9);中间体5与中间体9经Suzuki偶联反应得到达萨布韦,其结构经1H-NM R、13C-NM R、IR和MS谱确证。结果与结论确定了达萨布韦的合成路线并进行工艺优化,总收率达29.0%(以邻叔丁基苯酚计)。该工艺路线所用原料价廉易得、操作简便、条件温和,为达萨布韦的工业化生产奠定了基础。