摘要：由于全长丙型肝炎病毒ns5b的疏水性 ,其表达和纯化非常困难。为了分泌表达ns5b ,作者对ns5b进行截短 ,缺失其疏水部分从而在大肠杆菌细胞中分泌表达HCVns5b基因 ,并测定其活性。用逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)的方法 ,设计截去ns5b疏水部分 ,PCR引物以HCV全长质粒pbRTM/HCV 1为模板 ,克隆到pGEM Teasy载体中 ,双酶切后回收连接到pET 2 1b中表达。大肠杆菌培养上清过柱纯化 ,进行十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和Western免疫印迹分析 ,并用液闪近端分析 (SPA)法分析ns5bRdRp活性。成功地构建了ns5b基因大肠杆菌表达载体 ,Western免疫印迹显示ns5b蛋白在大肠杆菌细胞中表达。表达产物在大肠杆菌培养上清中存在 ,分子量 6 8kD左右 ,而且 [3 H]总掺入率达 6 90 0cpm。ns5b蛋白在大肠杆菌上清中表达成功 ,经过活性测定 。

摘要：猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)引起的猪瘟(hog cholera).目前主要使用弱毒活疫苗防治,但弱毒活疫苗的使用存在着局限性和危险,因为活疫苗株有可能与野毒重组或进行自然突变而造成毒力返强,还可通过母猪胎盘感染造成胎猪死亡;而感染后不死产下的仔猪往往又成为CSFV的'携带者',这些猪对CSFV的特异性免疫应答水平很低,具有免疫耐受性,可长期带毒、排毒,导致疫苗保护失效[1].因此,进一步研制安全高效的新型疫苗和抗病毒制剂,是科学工作者一直努力的方向.RNAi(即双链RNA干涉)是近两年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法.它通过导入一段与内源基因同源的双链RNA(dsRNA)序列,使内源mRNA降解,从而达到阻抑基因表达的目的[2,3].Elbashir实验室在研究中发现具有21～22 bp的siRNA在哺乳动物细胞中可以诱发RNAi效应[4],后又经大量实验证明短双链RNA(siRNA)在哺乳动物细胞中可抑制内源性基因和外源性基因表达.本实验利用已有的ns5b cDNA,构建真核表达的质粒载体,并设计合成针对CSFV ns5b基因的dsRNA,经酶切获得26 bp的siRNA,研究RNAi阻断ns5b基因表达的效应,为研制抗CSFV新型药物提供一定的参考.

摘要：目的构建表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因ns5b的重组腺病毒表达载体,并对其相关指标进行鉴定,为进一步研究防止丙型肝炎感染的基因免疫和基因治疗奠定实验基础。方法应用基因工程技术将HCVns5b基因定向克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pbHGloxΔE1、3Cre和穿梭质粒pDC316-ns5b共转染293细胞,进行同源重组,产生重组腺病毒pAd-ns5b并进行鉴定、反复感染293细胞进行扩增,扩增后测定重组病毒滴度。结果重组病毒颗粒pAd-ns5b经双引物PCR、凝胶电泳证明插入片段与HCV非结构基因ns5b片段大小相符;经测序证明其插入序列与设计HCV ns5b基因序列完全一致,扩增后重组病毒滴度达到2.3×1013IU/L。结论成功构建了表达HCV ns5b基因的重组腺病毒载体。

摘要：【目的】建立一种新型的、能在基层场地进行实时便捷诊断的猪瘟病毒检测方法。【方法】环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)-横向流动试纸条技术(Lateral flow dipstick,LFD)相结合,针对猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)ns5b基因设计一套特异性引物及生物素标记探针,结合异硫氰酸荧光素标记的扩增产物,建立RT-LAMP-LFD检测方法。【结果】所建立的方法能够特异地检测出CSFV的存在,检测PRRSV、JEV、PCV-2等其他病毒均为阴性;所建立的CSFV-RT-LAMP方法对RNA的最低检测限为50 pg;反应快速,整个扩增反应可在1 h内完成;操作简单,不需要PCR仪等复杂的仪器,结果可经肉眼观察。【结论】应用RTLAMP-LFD检测CSFV特异性强、灵敏度高,并且操作安全、简便、快捷,可以满足基层检疫的需要。