摘要：乙肝病毒X蛋白(Hepatitis B virus X protein,HBx)是乙肝病毒诱导肝癌进展的关键因子,其能够影响肝癌细胞周期和促进其迁移。已知趋化因子受体3(chemokine CXC motif receptor 3,CXCR3)在乙型肝炎病毒肝癌中发挥促进作用,目前尚不清楚CXCR3在HBx诱导的肝癌细胞中的作用。因此,本研究探讨下调CXCR3对HBx诱导的肝癌细胞周期进展和迁移作用及机制。肝癌细胞Huh7分成对照组,pcDNA组(转染阴性对照载体),pcDNAHBx组(转染HBx过表达载体),pcDNA-HBx+si-NC组(共转染HBx过表达载体、siRNA对照的),pcDNA-HBx+si-CXCR3组(共转染HBx过表达载体、CXCR3 siRNA的),pcDNA-HBx+si-CXCR3+Jagged1组(共转染HBx过表达载体、CXCR3 siRNA,notch1信号激活剂Jagged1处理),测定细胞中HBx、CXCR3、神经性钙黏附素(Neural cadherin,N-cadherin)、基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloprotease 9,MMP-9)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloprotease 2,MMP-2)、上皮性钙黏附素(Epithelical cadherin,Ecadherin)、波形蛋白(Vimentin)、notch神经同源蛋白1前体(Neurogenic locus notch homolog protein 1 precusor,notch1)、Hes1蛋白表达,检测细胞增殖、周期和迁移、侵袭情况。结果表明,与Control、pcDNA组比较,pcDNAHBx组肝癌细胞中HBx、CXCR3、notch1、Hes1、Cyclin D1、PCNA、MMP-9、MMP-2、vimentin、N-cadherin蛋白表达量升高,细胞增殖活性、迁移数目、侵袭数目升高,细胞G0/G1期比例、E-cadherin蛋白表达量降低(P<0.05);与pcDNA-HBx+si-NC组比较,pcDNA-HBx+si-CXCR3组肝癌细胞中CXCR3、notch1、Hes1、Cyclin D1、PCNA、MMP-9、MMP-2、vimentin、N-cadherin蛋白表达量降低,细胞增殖活性、迁移数目、侵袭数目降低,细胞G0/G1期比例、E-cadherin蛋白表达量升高(P<0.05);与pcDNA-HBx+si-CXCR3组比较,pcDNA-HBx+si-CXCR3+Jagged1组肝癌细胞notch1、Hes1、Cyclin D1、PCNA、MMP-9、MMP-2、vimentin、N-cadherin蛋白表达量升高,细胞增殖活性、迁移数目、侵袭数目升高,细胞G0/G1期比例、E-cadherin蛋白表达量降低(P<0.05)。结果表明,下调CXCR3通过抑制notch1信号减弱HBx促进肝癌细胞周期进展和迁移作用。本研究证明了下调CXCR3对HBx促进肝癌细胞周期进展、迁移、侵袭和EMT的作用,并首次发现了其作用机制与notch1信号有关。

摘要：目的探讨RNA干扰技术沉默notch1基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法设计并合成靶向notch1基因的小分子干扰RNA质粒,在转染试剂Sofast介导下转染人乳腺癌细胞株MCF-7,用RT-PCR和Western blot法检测转染前、后notch1基因的表达,挑选干扰效率最强的一组表达载体;cck8比色法检测分析各组细胞的存活率;流式细胞术检测细胞凋亡比例;Western blot法检测转染各组MCF-7细胞notch1、NF-κB及Caspase-3蛋白表达。结果 notch1-shRNA能有效封闭notch1基因的表达,notch1基因和蛋白表达水平明显降低(P<0.05);notch1-shRNA能明显抑制细胞增殖(P<0.05);转染48h后细胞凋亡比例增加(P<0.01)。NF-κB蛋白水平表达降低,Caspase-3蛋白表达水平增高。结论利用RNA干扰技术沉默notch1基因的表达可以明显抑制MCF-7细胞的增殖,促进MCF-7细胞凋亡,其机制可能通过NF-κB信号通路调节相关凋亡蛋白的表达,进而影响细胞的凋亡和增殖,靶向notch1的RNA干扰技术在乳腺癌的基因治疗中具有一定的研究价值。

摘要：目的:通过siRNA技术,探讨notch1靶向沉默对人绒毛膜上皮癌JEG3细胞增殖及侵袭力的影响。方法:设计并合成notch1-siRNA寡核苷酸链,将与人类基因无同源性的siRNA片段作为阴性对照,分别转染JEG-3细胞。将JEG-3细胞进行分离培养,并分3组:未转染正常对照组(NT)、转染对照siRNA的阴性对照组(CS)、转染notch1 siRNA基因沉默组(NS)。利用MTT法检测细胞增殖情况,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果:NS组细胞增殖情况显著低于NT组和CS组。侵袭实验结果显示NS组侵袭细胞数目(58.3&#177;4.2)明显少于NT组(109.2&#177;6.3)与CS组(116.8&#177;5.9)(P<0.05)。结论:notch1靶向沉默能够减缓JEG-3细胞增殖,降低侵袭能力,提示notch1可能是治疗人绒毛膜上皮癌的靶点。

摘要：目的筛选并包装notch1基因shRNA低表达的慢病毒,感染稳定表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心蛋白(core)的肝癌细胞,在此基础上建立低表达notch1基因的SMMC7721-Core稳定转染细胞株。方法设计针对notch1基因mRNA的干扰序列,并将其连接入载体质粒,转染HEK293T细胞,构建带有notch1基因的慢病毒表达载体,感染稳定表达HCV Core蛋白的人肝癌细胞株SMMC7721-Core,采用定量聚合酶链反应(quantitative PCR,qPCR)和免疫印迹法(Western blot)检测干扰效果。结果构建了带有干扰notch1基因的慢病毒表达载体,感染SMMC7721-Core细胞后筛选获得稳转细胞株,qPCR测得notch1 mRNA低表达,Western blot检测到notch1蛋白低表达。结论成功构建了notch1低表达SMMC7721-Core人肝癌稳定转染细胞株,为进一步开展对HCV Core蛋白诱导肝癌过程中notch1所起作用的研究提供了依据。

摘要：目的:构建人特异性受体notch1短发夹RNA重组腺病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞中notch1表达的影响,以便进一步研究notch1的生物学功能。方法:设计合成notch1序列干扰序列,插入到pGenesil-1.1上构建重组质粒,取阳性克隆进行酶切及DNA测序鉴定。通过同源重组,构建含目的基因的重组腺病毒质粒载体pGsadeno-notch1-shRNA。经Pac I线性化后脂质体介导转染到HEK 293细胞,包装后得到腺病毒颗粒。产生的重组腺病毒体外转染人脐带间充质干细胞,RT-PCR和Western blot检测特异性shRNA对人脐带间充质干细胞中notch1蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果。结果:经酶切及DNA测序重组腺病毒质粒构建正确。重组腺病毒转染人脐带间充质干细胞3 d后,RT-PCR及Western blot检测,可显著下调细胞内notch1的转录及蛋白表达水平。对notch1 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为70.31%和86.97%,具有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建了表达人notch1受体shRNA的重组腺病毒载体,为研究notch1在肿瘤学中的生物学作用及机制奠定基础。

摘要：目的:构建并鉴定靶向notch1基因的siRNA真核表达载体。方法:根据notch1基因cDNA序列,设计靶向目的基因的3个siRNA靶序列,将其插入U6启动子下游,克隆到真核表达载体pGsensil中,并进行酶切鉴定和DNA测序鉴定。采用脂质体介导法将构建好的3个siRNA表达载体分别转染T24人膀胱癌细胞中,荧光下观测转染效率。RT-PCR检测notch1基因mRNA在转染前后的表达。结果:转染48h后3个siRNA表达载体均不同程度的抑制了notch1 mRNA的表达。酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。结论:成功构建的靶向notch1的siRNA真核表达载体,具有抑制notch1基因mRNA表达的功能,可能为膀胱癌基因治疗研究提供一个新的方向。

摘要：目的检测Hey1与notch1在非小细胞肺癌组织中的表达,探讨Hey1在非小细胞肺癌中的表达与notch1的表达、各临床病理特征之间的关系。方法制作组织芯片,采用免疫组织化学染色检测notch1和Hey1在246例非小细胞肺癌组织及相应117例癌旁正常肺组织中的表达,应用SPSS 21.0进行统计分析。结果 notch1在肺鳞癌、肺腺癌和癌旁正常肺组织的阳性率分别为78.8%,28.9%和30.8%,Hey1在肺鳞癌、肺腺癌和癌旁正常肺组织中的阳性率分别为79.7%,23.4%和33.3%;肺鳞癌患者notch1阳性表达与TNM分期和淋巴结转移情况呈正相关;肺鳞癌患者Hey1阳性表达与TNM分期呈正相关,与肿瘤分化程度呈负相关;Spearman相关分析显示,肺鳞癌和肺腺癌组织中notch1表达与Hey1表达具有显著的正相关关系。结论 Hey1和notch1与肺鳞癌的恶性程度密切相关,可能是肺鳞癌发生、发展的重要参与因子。