摘要：目的本实验旨在高效表达可溶性的o型口蹄疫病毒VP1蛋白,并形成纳米样颗粒。方法根据o型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV o/MYA/7/98株的VP1蛋白基因,并进行截短和优化,共73个氨基酸;同时,从肠道沙门菌(Salmonella enterica)中分离得到135个氨基酸铁蛋白(Fn)基因片段,将o型口蹄疫病毒VP1蛋白与铁蛋白串联,设计并合成了口蹄疫病毒VP1蛋白-铁蛋白基因片段,命名为Se Fnt16798。构建了Se Fnt16798融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、Ars C、Ppi B、Ce HSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选高效可溶性表达的Se Fnt16798融合蛋白。重组蛋白通过Ni-NTA Agarose亲和纯化,进行电子显微镜检测。结果实验成功构建9个Se Fnt16798表达载体;9个标签中,MBP与Se Fnt16798蛋白相融合的可溶性表达效果最好,并获得了高纯度的MBP-Se Fnt16798重组蛋白质;电子显微镜结果显示,MBP-Se Fnt16798形成了纳米样颗粒。结论本实验建立了稳定获得Se Fnt16798重组蛋白质的方法。

摘要：为建立o型口蹄疫病毒(FMDV-o)和塞内卡病毒(SVV)快速鉴别检测方法,本实验根据FMDV-o VP2基因序列和SVV P3基因序列,采用Primer Express3.0软件分别设计引物与探针,并经各反应条件的优化初步建立了可同时鉴别检测FMDV-o和SVV的双重荧光定量RT-PCR方法。利用该方法检测临床常见猪病毒,结果显示可同时检测出FMDV-o和SVV核酸,且与猪水泡性口炎病毒(VSV)、猪水疱病毒(SVDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、A型口蹄疫病毒(FMDV-A)、A-1型口蹄疫病毒(FMDVA-1)核酸均无交叉反应,并可检测到FMDV-o PanAsia株、cathay株、Ind-2001株和Mya-98株等主要流行株,特异性强;该方法对含FMDV-o和SVV拼接质粒标准品的最低检测限为7.17×10^(2)拷贝/μL,敏感性高;利用该方法检测了同一时间和不同时间提取的3种不同浓度的质粒标准品,结果显示批内和批间重复性试验Ct值的变异系数均小于3%,重复性好。利用本实验所建立的方法对30份临床样品进行检测,结果与各病毒单一荧光定量RT-PCR检测结果一致。本研究建立的FMDV-o和SVV双重荧光定量RT-PCR方法能够快速准确的鉴别检测FMDV-o和SVV,为口岸检疫的快速通关提供了技术手段。

摘要：本试验旨在表达出高可溶性的o型口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白，并通过电镜检测，以期望形成纳米样颗粒。根据o型FMDV核酸序列，得到FMDVo／GER／Wup／82株的衣壳蛋白基因，并进行截短和优化，共133个氨基酸；同时，从肠道沙门菌（Salmonella enterica）中分离得到135个氨基酸铁蛋白（Ferritin）基因片段，将o型FMDV衣壳蛋白与铁蛋白串联，设计并合成了FMDV衣壳蛋白-铁蛋白基因片段，命名为SeFntl6599。构建了SeFnt16599融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、7-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG诱导，SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测，筛选出高可溶性表达的SeFnt16599融合蛋白。重组蛋白通过Ni—NTA Agarose亲和纯化，进行电镜检测。结果表明，成功构建9种SeFnt16599表达载体；9个标签中，MBP与SeFnt16599蛋白相融合的可溶性表达效果最好，并获得了高纯度的MBP—SeFnt16599重组蛋白质；电镜结果显示，MBP—SeFnt16599形成了纳米样颗粒。本试验建立了稳定获得SeFnt16599重组蛋白质的试验方法，为FMDV衣壳蛋白新型结构疫苗的开发及后续研究奠定了基础。

摘要：利用基因克隆和体外转录技术制备o型口蹄疫病毒（FMDV）核酸检测标准样品.设计o型FMDV 3D基因的全长开放阅读框的克隆引物,RT-PCR获得相应片段,连接至PGEM-T载体,测序后采用体外转录方法制备RNA纯品,初步定量稀释后,混合分装作为核酸标准样品候选物.采用实时荧光定量RT-PCR方法进行均匀性和稳定性检验,并委托外部实验室采用外标实时定量RT-PCR方法对转录的RNA片段进行定值.通过绘制荧光定量标准扩增曲线计算标准物质含量（拷贝数）,并根据委托单位的定值结果进行不确定度的估算.均一性结果显示瓶间差异小于5％,稳定试验表明室温20℃～25℃（相对湿度20％～50％）14 d,2℃～8℃3个月及-20℃保存1年的含量均无明显变化.核酸标准物质定值为（1.260士0.485）×108 copies,可用作o型FMDV通用核酸检测的标准质控品.

摘要：为构建表达o型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)衣壳蛋白的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体的重组腺病毒,本研究设计、合成特异性引物并扩增出FMDV-oZK93的P12A、3B3C基因,通过融合PCR方法连接2个片段,获得P12A3B3C基因后插入到pDC316-mCMV-EGFP质粒,构建了能够表达FMDV-oZK93株衣壳蛋白前体P12A和3B3C蛋白酶的重组穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP-P12A3B3C。利用AdMax^(TM)腺病毒包装系统进行重组腺病毒rAdv-P12A3B3C-oZK93的包装、鉴定及扩增;并感染人胚胎肾细胞HEK-293进行表达验证。将鉴定正确且高度纯化后的重组腺病毒肌肉免疫小鼠进行免疫原性分析。结果显示,rAdvP12A3B3C-oZK93在病毒传代过程中目的基因稳定存在,且病毒滴度可达1×10^(9.1)TCID_(50)/mL。间接免疫荧光和Western blotting结果均表明rAdv-P12A3B3C-oZK93在HEK-293细胞中表达了FMDV特异性蛋白P12A和VP1。PK细胞感染实验证明rAdv-P12A3B3C-oZK93可感染猪源细胞,这为构建的rAdv-P12A3B3C-oZK93用于猪对抗FMDV的免疫与保护奠定了基础。相比于FMDV灭活疫苗免疫的小鼠,重组腺病毒免疫小鼠后可诱导机体产生更高水平的FMDV特异性抗体以及γ-IFN和IL-10应答反应,表明该重组腺病毒可对动物机体产生良好的免疫原性,为后续研制新型口蹄疫活载体疫苗奠定了重要基础。

摘要：本研究根据口蹄疫病毒 (FMDV)VP1基因的序列 ,设计并合成了 1对用于扩增整个VP1基因的引物 (5P、P6 )。从细胞培养液或组织中提取总RNA ,通过PT_PCR扩增 ,从F2 9株、o3I3株和T5 0 9株中均获得了 1条约 740bp的DNA电泳带。将PCR产物双酶切后电泳回收 ,插入到相应双酶切的pUC18质粒中 ,获得了重组质粒。通过PCR鉴定 ,证明重组质粒pUCVP1/F2 9、pUCVP1/o313、pUCVP1/T5 0 9均插入了VP1基因。对上述 3个重组质粒进行测序后分析 ,F2 9强毒株与o3I3、T5 0 9弱毒株相比 ,其核苷酸序列同源性分别为 98.75 %和 99.0 6 % ;因F2 9株核苷酸发生 3个碱基缺失与 1个碱基替换 ,故推导的氨基酸序列同源性分别仅为 44 .13%和 41.32 % ;而T5 0 9株与o3I3株相比 ,其核苷酸、氨基酸序列同源性分别为 99.37%和 95 .31%。通过序列分析发现 ,本研究的 3个毒株与国内大多数毒株 (包括 1997年台湾暴发FMDV所分离的毒株 ,除o/A/ 5 8株外 )均属于同一基因型 ,核苷酸序列同源性为 85 %～ 94% ;而与国外毒株相比 ,属不同的基因型 ,核苷酸序列同源性仅为 81%～ 82 %。其推导的氨基酸序列 ,除F2 9株与o/HK/ 93株及 1997年台湾暴发FMDV分离的少数毒株的氨基酸序列同源性仅为 45 %～ 6 3%外 ,本研究的

摘要：综合运用生物信息学和分子生物学技术,模拟PPV VP2蛋白表面不同Loop区插入o型FMDV VP1蛋白上多表位基因(VP1:21～40、141～160和200～213残基)空间构象,并在VP2 N端引入通用型辅助性T淋巴细胞表位(PADRE),人工合成嵌合基因并克隆到杆状病毒转移载体pFastBac HTA中,转化*** DH10Bac感受态细胞,经三抗筛选,获得重组杆状病毒表达质粒rBac-FMDV VP1∶PPV VP2,用脂质体法转染Sf9细胞。对rBac-FMDVVP1∶PPV VP2感染的Sf9细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光;用Western-blotting分析,在64 000处出现一条特异蛋白条带;电镜观察,重组VP2蛋白能够自主组装成病毒样颗粒。红细胞凝集试验证实,表达的嵌合蛋白PPV∶VP2-FMDV∶VP1具有与全病毒类似的血凝活性。

摘要：为制备猪塞内卡病毒(SVA)和o型口蹄疫病毒(FMDV-o)阳性质控品,根据选择的目的基因片段,设计阳性参考品序列,通过基因拼接技术和装甲RNA技术,制备含有口蹄疫o型病毒和塞内卡病毒目的基因的装甲RNA病毒样颗粒,用来作为塞内卡病毒(SVA)和o型口蹄疫病毒(FMDV-o)的阳性参考品。结果表明,该阳性质控品无生物传染性,可以真实模拟病毒粒子结构,耐受DNaseI及RNaseA,稳定性高,在-70℃保存18个月,荧光RT-PCR检测结果均无显著差异。本试验制备的含有猪o型口蹄疫病毒和塞内卡病毒目的基因的装甲RNA病毒样颗粒,可以作为SVA和FMDV-o双重荧光RT-PCR检测方法中进行质量控制的阳性参考品。

摘要：根据GenBank中o型和Asia1型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)的vp3、vp1和2A基因序列,并与其它血清型FMDV的对应基因序列进行比较,设计用于扩增o型和Asia1型FMDV vp1基因的特异性引物,建立o型和Asia1型FMDV RT-PCR鉴别诊断方法。本方法首先用通用型引物进行RT-PCR,确定是否为FMDV感染,然后用特异性引物鉴别o型或Asia1型FMDV的感染。用vp1基因序列分析进行符合性试验,验证了该方法所具有的特异性和敏感性。本方法可用于o型和Asia1型FMD的快速诊断及流行病学调查。