摘要：为了确定猪戊型肝炎病毒(HEV)orf2抗原性片段的分布,参考中国T1株序列设计套式引物,从新鲜猪粪中扩增出HEV部分基因片段,长1725bp,位于orf2第205～1929bp之间,命名为HEVorf2-A。根据HEVorf2-A序列设计了3对引物,分别扩增HEVorf2-A三段连续的基因片段,命名为HEVorf2-B1、HEVorf2-B2、HEVorf2-B3,分别位于HEVorf2-A第1～576bp,577～1149bp,1150～1725bp之间。将这4段扩增的基因片段分别与表达载体pET32a(+)连接,并转入BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析。结果显示,经1mmol/LIPTG37℃诱导6h后,除pET32a-A在82.6ku处有微量融合蛋白表达外,pET32a-B1、pET32a-B2、pET32a-B3分别在41.3ku、41.5ku、41.8ku处有高水平的融合蛋白表达。用自然感染猪血清和北京万泰HEVELISA诊断试剂盒阳性对照血清进行Western-blot分析,结果3个短的融合蛋白均能检测到明显的条带,表明构建的3个表达载体具有良好的抗原性。

摘要：根据GenBank中猪2型圆环病毒(PCV-2)的核酸序列,设计了1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出了orf2基因,将其克隆到pMD18-T载体上,筛选获得了重组质粒pMD18-T-orf2.对此重组质粒进行序列测定分析,结果表明,克隆的orf2基因与其他PCV-2的orf2核苷酸序列同源性为92.0%～93.3%,推导氨基酸序列的同源性为82.9%～84.6%.重组质粒pMD18-T-orf2经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,将回收的orf2基因转移入真核表达载体pIRES,成功构建了重组质粒pIRES-orf2.

摘要：为了研制猪戊型肝炎(HE)基因工程疫苗,设计引物扩增猪戊型肝炎病毒(HEV)的基因片段LB1、LB2、LB3,分别与真核表达载体pEASY-M1Expression Vector直接进行T-A连接,构建得到了重组真核表达质粒pEASY-LB1、pEASY-LB2、pEASY-LB3。将这3个重组真核表达质粒分别转染293T细胞,采用实时荧光定量RT-PCR检测目的基因,并进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定。结果显示,重组真核表达质粒pEASY-LB1、pEASY-LB2、pEASY-LB3在转染的293T细胞中均可表达一约20.5ku的目的蛋白,且具有良好的HEV抗原性。本试验获得的3个HEV orf2连续片段的候选核酸疫苗为今后进一步研制HEV核酸疫苗奠定了基础。

摘要：为了给猪圆环病毒2型的诊断和基因工程疫苗的研究奠定基础,试验根据GenBank中猪圆环病毒2型的核酸序列设计了1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪病料组织中扩增出了orf2基因,将其克隆到pMD18-T载体上,筛选获得了重组质粒pT-orf2。结果表明:以重组质粒pT-orf2为模板设计出1对引物,扩增出含orf2主要抗原位点的区段566 bp,经Bam HⅠ和H indⅢ双酶切,将回收的orf2基因转移入真核表达载体pcDNA3.0,成功构建了重组表达质粒pcDNA3.0-orf2。

摘要：根据GenBank中猪2型圆环病毒(PCV2)序列(AY035820),设计1对引物,并以包含PCV2全基因组的重组质粒pT-PCV为模板,扩增出含orf2全基因的片段(709bp),回收PCR产物,将其克隆入pMD18-T载体,获得重组质粒pTorf2,并对其进行序列测定。重组质粒经Bal 和Sal 双酶切,回收orf2基因,将其插入pGEX-KG的Sma 和Sal 位点间,构建原核表达质粒pGEXorf2,阳性重组质粒转化***21(DE3),进行原核表达。用此表达产物包被酶标板,建立ELISA诊断方法,并对临床676份送检血清进行了检测,结果表明其总阳性率为62.7%(424/676),仔猪阳性率为38.9%(74/190),肥猪阳性率为63.2%(84/133),母猪阳性率为74.6%(249/334),公猪阳性率为89.5%(17/19)。

摘要：通过重叠区扩增法(PCR-based accurate synthesis,PAS)人工合成猪附红细胞体orf2基因,并使其在大肠杆菌(DE3)中高效表达。根据GenBank注册的AJ504999的orf2基因序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成11对寡核苷酸片段,用PAS方法,人工合成orf2基因。基因克隆入pMD18-T载体,经测序证实正确后,连接到表达载体PET-28a,获得重组表达质粒PET-28a/orf2,导入大肠杆菌BL21(DE3),在37℃,IPTG终浓度1mmol/L的条件下诱导表达,经SDS-PAGE分析,Western-blot鉴定,在35 000附近出现目的片段。同时通过生物信息学软件对其蛋白二级结构及抗原表位等方面进行预测。

摘要：【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)orf2原核表达质粒载体,高效重组表达PCV2壳蛋白Cap,为进一步建立PCV2 ELISA的检测方法及Cap蛋白单克隆抗体的制备研究奠定基础。【方法】根据猪圆环病毒2型orf2基因序列设计带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的引物,进行orf2的PCR体外扩增。用扩增的orf2基因构建pMD18-T-orf2质粒,经测序检测正确后,与pET-32a(+)连接获得原核表达重组质粒pET-32a-orf2。重组质粒pET-32a-orf2转化BL21-ΔE3后用IPTG诱导表达,对获得的纯化表达产物进行了SDS-PAGE电泳、Western blot检测。【结果】PCR扩增得到了预期580 bp的目的基因,连接载体后经测序完全正确;pET-32a-orf2在BL21-ΔE3得到高效表达,获得以包涵体形式存在的体外重组原核表达PCV2 Cap蛋白;Western blot检测结果表明,所得到的蛋白能够识别PCV2多克隆抗体。【结论】重组质粒pET-32a-orf2在BL21-ΔE3高效表达重组PCV2 Cap蛋白,且具有免疫学生物活性。

摘要：利用分子生物学软件分析GenBank公布的猪戊型肝炎病毒DQ1株orf2的氨基酸序列,确定了其C端抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了一对特异性引物,RT-PCR扩增该区域,并将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,命名为pET30a-orf2C,然后转化大肠埃希菌BL21感受态细胞,1.0 mmol/L IPTG 37℃诱导表达。结果表明,RT-PCR扩增得到301 bp的片段,重组蛋白大小约为18 ku,与预期大小相符。Western blot分析表明,该蛋白与阳性血清发生特异性反应,为进一步利用其建立诊断方法奠定了基础。

摘要：根据发表的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)orf2基因序列,设计合成1对特异性引物,从分离到的PCV2吉林株(JL01)中扩增出PCV2 orf2579 bp的核苷酸片段,克隆到表达载体pET-32a中,经BamHⅠ和HindⅢ酶切及序列分析获得阳性重组表达质粒pET-32a-orf2。将其转化到表达宿主菌BL21中,经IPTG诱导,成功表达了orf2基因编码的部分结构蛋白,分子量为40 kD。通过SDS-PAGE和Western检测表明,表达的重组蛋白能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的反应原性。

摘要：根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)orf2基因序列,设计了1对引物,应用PCR从含有PCV-2的PK-15细胞中扩增出orf2基因,将其克隆入pSecTag2载体中,构建了pSecorf2载体。又设计一条含信号肽序列的上游引物,以pSecorf2为模板,扩增出含信号肽序列的orf2基因,将其克隆到pIREShyg载体上,构建了pIRESiorf2真核表达载体。然后通过磷酸钙共沉淀法转染CHO细胞,进行表达。间接免疫荧光实验(IFA)成功检测到pIRESiorf2在CHO细胞中的表达。这为进一步研究orf2编码蛋白的生物学活性及建立PCV诊断试剂盒打下基础。