摘要：猪圆环病毒2型(porcine Circovirus type 2,PCV2)感染给养猪业造成巨大的经济损失,而PCV2orf1、orf2和orf3与PCV2的复制、免疫原性及致病机理密切相关。本研究制备PCV2orf1、orf2和orf3多克隆抗体,为进一步研究PCV2orf1、orf2和orf3的功能提供材料。依据PCV2全基因组序列,分别设计针对PCV2orf1、orf2和orf3编码基因的特异性引物,PCR扩增后,克隆入原核表达载体pET-32a的BamHⅠ/NcoⅠ和HindⅢ位点之间,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组原核表达载体分别命名为pET-orf1、pET-orf2和pET-orf3。重组质粒分别转化*** BL21菌株,1 mmol/L IPTG诱导表达orf1、orf2和orf3重组蛋白,SDS-PAGE测定结果表明其相对分子质量分别约为52 000、39 000和29 000。大量诱导重组蛋白表达后,回收目的蛋白条带、匀浆后免疫新西兰大白兔,制备兔抗PCV2orf1、orf2和orf3重组蛋白血清。兔抗血清纯化后,Western blot检测抗血清与重组蛋白的特异性结合情况及其效价,证明所制备多克隆抗体均具有较强的特异性,效价均高于1∶10 000。

摘要：为了研究含有猪圆环病毒2型(porcinecircovirus type 2,PCV2)的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,本试验根据GenBank中猪圆环病毒2型基因序列,设计了1对引物,用于猪圆环病毒2型orf2基因的扩增。将目的基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-orf2。经PCR方法和限制性内切酶酶切法及测序证明该基因已成功连接后,重组腺病毒转移载体经PmeⅠ酶切线性化,在BJ5183细菌中与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-CMV-orf2。经PCR方法和PacⅠ酶切方法及测序鉴定表明该重组腺病毒载体已构建成功。PacⅠ酶切线性化pAd-CMV-orf2,脂质体法转染AD293细胞进行病毒的包装和扩增。PCR及RT-PCR、IFA、Westernblotting检测目的基因及其表达。结果表明,本试验成功构建了重组腺病毒pAd-CMV-orf2。3次噬斑试验纯化重组腺病毒,测得其TCID50为10-8.75/0.1mL。将重组腺病毒接种SPF级雌性BALB/c小鼠,用ELISA抗体检测试剂盒检测特异性抗体水平。小鼠免疫试验测得其特异性抗体水平较高,为PCV2重组腺病毒基因工程疫苗的进一步研究打下基础。

摘要：用原核表达系统表达猪戊型肝炎病毒orf2蛋白N端的主要抗原表位区。通过对GenBank公布的猪戊型肝炎病毒DQ1株orf2的氨基酸序列进行分析,确定了其N端抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了1对特异性引物,RT-PCR扩增该区段,并将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,命名为pET30a-orf2N,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,1.0 mmol/LIPTG37℃诱导表达。RT-PCR扩增得到424 bp的片段,重组蛋白大小约为21.8 ku,与预期大小相符。West-ern blotting分析结果表明,该蛋白能与阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有生物学活性。猪戊型肝炎病毒orf2蛋白N端主要抗原表位区在大肠杆菌中成功表达,具有一定的反应原性,为进一步用其建立诊断方法奠定基础。

摘要：根据ＧｅｎＢａｎｋ中猪圆环病毒２型（ＰＣＶ－２）ＯＲＦ２基因序列，设计一　对引物，应用ＰＣＲ从疑患断奶仔猪多系统消耗综合症（ＰＭＷＳ）的死亡仔猪组织病料中扩增出ＯＲＦ　２全基因（７０２ｂｐ）。将此片段克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ　ｅａｓｙ载体，筛选获得重组质粒ｐＴＯＲＦ２，并对此质　粒中的插入序列进行了测序分析，结果表明本试验克隆的ＯＲＦ２与美国ＰＣＶ－２分离株ＡＦ２６４０３９　的核苷酸及氨基酸序列同源性均达到１００％，与其他ＰＣＶ－２毒株同源性分别为９２．３％～９８．　６％和　９２．３％～９６．６％。重组质粒ｐＴＯＲＦ２经　Ｂａｍ　Ｈ　Ｉ、Ｅｃｏ　Ｒ　Ｖ双酶切，回收ＯＲＦ２基因，转　移入真　核表达载体ｐＳｅｃＴａｇ２／ＨｙｇｒｏＢ的相应酶切位点之间，构建成重组质粒ｐＳｅｃＴａｇＯＲＦ２。此重组表　达载体的构建成功为进一步研究ＯＲＦ２编码蛋白的生物学活性及建立ＰＣＶ诊断试剂盒打下基础。

摘要：根据鸡传染性贫血病毒（ＣＩＡＶ）ＣＵＸ－１标准毒株ＤＮＡ序列中ＯＲＦ２基因片段设计一对引物，对ＣＵＸ－１进行扩增，得到大小为６８４ｂＰ的片段，符合设计目的。以疑似ＣＩＡＶ的分离物ＳＲ４３感染鸡马立克氏病淋巴瘤细胞（ＭＳＢ１），提取全细胞ＤＮＡ，用该引物进行扩增，也得到同样大小的片段。在使用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ，３７℃对ＣＵＸ－１和ＳＲ４３的ＰＣＲ产物酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分析，均获得４３３ｂＰ和２５１ｂＰ两个条带。初步证明。

摘要：根据家蚕浓核病的典型病症,推测云南省陆良县蚕区病蚕感染该病毒;为进一步确认家蚕感染浓核病病毒,参照家蚕浓核病病毒-镇江株(Bombyx mori densonucleosis virus-3,Bm DNV-3)基因组VD1链非结构蛋白基因1orf2序列设计特异性引物,以病蚕基因组为模板进行PCR扩增来检测该蚕区的病蚕是否感染Bm DNV,PCR检测结果得知,在陆良县收集的14户蚕农病蚕样品中有7组样品感染了Bm DNV;为进一步了解该地区病毒与已报道病毒株系间的进化关系,纯化该病毒并提取基因组,回收VD1 orf2上下游引物扩增得到的PCR产物并克隆该基因片段(Gen Bank登录号:KR909094);收集NCBI已登录非结构蛋白1基因序列构建系统发生树,从进化树可以得知,Bm DNV-3与家蚕浓核病病毒-陆良株(Bombyx mori densonucleosis virus-Luliang,Bm DNV-Luliang)聚为1支,说明分离得到的Bm DNV为Bm DNV-3的1个分离株系,为下一步研究病毒与宿主间基因组进化提供理论依据。

摘要：猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白由orf2编码。采用PCR技术扩增得到orf2基因片段,克隆入p UCm-T载体,构建了重组质粒p UCm-PCV2-orf2。根据p UCm-PCV2-orf2测序结果设计引物,用Pfu酶扩增替换稀有密码子三联体。改造后的基因片段连接入表达载体p GEX-4T-1,并转化到BL21(DE3)宿主菌,成功构建了GST-PCV2-orf2蛋白大肠杆菌工程菌。经诱导表达后,对以包涵体形式存在的GST-PCV2-orf2重组蛋白进行纯化、复性。复性后的GST-PCV2-orf2重组蛋白具有良好的反应原性。

摘要：根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)orf2基因序列,设计一对引物,从分离的PCV-2GZ株、HN株的细胞培养物中扩增出orf2基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-orf2,并对其测序。结果表明,所克隆的orf2基因与其他PCV-2的orf2基因核苷酸序列同源性在90.6%～99.6%之间,推导的氨基酸序列同源性在88.9%～98.7%之间。

摘要：根据GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)orf2基因序列,设计一对引物,应用PCR从疑似断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出orf2基因(702 bp).将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-orf2并对其测序,结果表明所克隆的orf2基因与德国分离株AF201897核苷酸序列同源性为99.5%.与其它PCV-2的orf2核苷酸序列同源性在92.1%～99.9%之间,推导的氨基酸序列同源性在90.2%～99.5%之间.

摘要：根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)orf2基因序列,设计合成了一对引物,对PCV1orf2基因进行PCR扩增,将扩增出的orf2基因(702bp)克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒命名为pMD-orf2。由于orf2前面有120多个信号肽和序列中有大量的稀有密码子,所以将orf2进行改造并将改造的orf2双酶切产物插入原核表达载体pET-32α与pET-41α,得到重组子命名为pET-orf2-1与pET-orf2-2。用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Westernblot分析,结果表明PCV1-orf2在pET-32α和pET-41α中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子量约为30Kda和45Kda。