摘要：为探讨水牛oct4基因的表达调控模式,本研究扩增克隆了水牛oct4基因5′调控序列片段,并设计了-2 571bp、-2 389bp、-2 338bp和-2 191bp 4个不同长度的调控序列片段,分别构建了EGFP表达报告载体。通过生产转基因猪早期胚胎和转染水牛胎儿成纤维细胞分析了不同长度调控序列片段的转录活性。结果发现,在猪4.5d胚胎中各调控序列均能成功启动下游EGFP表达,但转染水牛胎儿成纤维细胞48h后均未观察到荧光。QRT-PCR分析显示,-2 571bp片段在4.5d猪胚胎细胞中的转录活性极显著高于其他调控序列(P0.05),二者均极显著高于-2 191bp(P<0.01)。上述结果表明水牛源oct4基因5′调控序列在猪早期胚胎中具有转录活性,且翻译起始位点上游2 191bp片段足以介导oct4在多能性细胞中的特异性表达;-2 389^-2 338bp片段上游的CR4亦参与了猪4.5d胚胎中oct4基因的转录调控。

摘要：根据GenBank中公布的猪oct4核苷酸序列设计合成1对引物,采用RT-PCR方法从巴马小型猪睾丸组织扩增oct4基因编码全序列。然后将该基因重组于含有绿色荧光报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建成pEGFP-oct4重组质粒,通过酶切电泳鉴定和DNA测序证明重组质粒构建成功。使用脂质体2000将pEGFP-oct4转染巴马小型猪肾脏成纤维细胞,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,转染细胞株中可检测到oct4的转录。结果表明,成功构建了真核表达载体pEGFP-oct4,并可在巴马小型猪肾脏成纤维细胞中表达,为进一步研究oct4基因生物学功能奠定了基础。

摘要：为了克隆出绵羊的oct4基因的编码区序列,研究利用RT-PCR技术,根据GenBank中小鼠、人,猪、牛等的oct4基因编码区序列设计出特异性引物,从绵羊囊胚中扩增绵羊oct4编码区序列并进行测序,分析。结果表明,绵羊oct4基因的编码区长度为1083bp,其中包括终止密码子,可以编码360个氨基酸。绵羊oct4基因CDS区的核苷酸序列与牛、猫、人、恒河猴、小鼠、兔、大鼠和猪等物种相似,比较相应序列,同源性分别为97.8%、91.1%、89.1%、89.0%、82.3%、85.7%、83.2%和94.7%;比较其氨基酸序列,同源性分别为98.3%、93.1%、91.4%、91.1%、83.8%、85.7%和97.2%;使用生物信息学软件分析结果表明,绵羊oct4基因含有两个POU特异结构域和1个HOMEOBOX-1结构域。本研究为进一步探索oct4基因的功能及探讨其在绵羊体细胞重编程的过程中的作用奠定了基础。

摘要：转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)已用于基因组编辑,而TALE转录激活因子(TALE-TFs)可用于内源基因的调控。通过修饰的TALE蛋白与内源基因的启动子特异性结合来激活或抑制基因的表达。但是,对于截短了N端的TALE是否会影响TALENs的效率还不确定。本文设计了不同长度N端的TALENs哺乳动物及酵母表达载体,对应哺乳动物绿色荧光报告载体及酵母报告载体。分别在哺乳动物细胞和酵母细胞上对不同长度N端TALENs的活性进行了检测。检测结果发现,含120个氨基酸N端的TALEN在酵母AH109细胞中的活性最高,N端长度为153个氨基酸的TALENs在293T细胞中表现最高的活性,但N端长度为153、140和160个氨基酸的TALENs的活性差异不显著(P>0.05)。随后,将结构优化了的TALE-TF用于小鼠胎儿成纤维细胞中激活oct4基因。相对阴性对照组,TALE-TF将oct4基因表达量上调了418倍。本研究结果表明,在哺乳动物细胞和酵母细胞中,具有最高活性TALENs的N端长度是不同的。本研究用结构优化的TALE-TF诱导内源基因高水平的表达,为从体细胞中获得iP S细胞提供了研究策略。