摘要：目的了解mir346和mir639对周期蛋白依赖激酶抑制剂2A(p16)基因表达的调控。方法以定点突变法为基础,设计获得c.-21 C>T和c.-34 G>T p16ink4a5'-UTR突变型。用选定的mirRNA和包含野生型和突变型p16ink4a5'-UTR的p GL3质粒共转染。24小时后进行双萤光素酶试剂(promega)检测分析和实时pCR定量分析。结果 Mir346和mir636相对mir639和mir935在MDF7和Mel28细胞有较高表达。随着mir346的导入,MCF7细胞野生型荧光酶活性显著降低(57%);突变型荧光酶活性也明显降低(39%)。并且在mir346存在时,野生型和突变型都显示出相同程度的表达量。mir639对WM266细胞荧光酶活动没有表现出显著影响。结论 mir346在MCF7细胞可显著下调p16的表达,而mir639在WM266细胞对p16的表达没有显著影响。

摘要：本研究构建真核表达载体pEGFp-BMI-1并观察其在HeLa细胞中的表达。将BMI-1逆转录聚合酶链反应(RT-pCR)产物克隆入pEGFp-N1,经酶切、pCR鉴定及测序分析,构建pEGFp-BMI-1真核表达载体;采用脂质体转染法,将融合基因pEGFp-BMI-1转入HeLa细胞,用荧光显微镜和Western blot检测其表达,SYBR Green I实时定量RT-pCR方法检测转染前后HeLa细胞中p16ink4a mRNA的表达变化。结果表明:重组后的pEGFp-N1质粒已成功载入BMI-1的全长编码基因,序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜下可见在转染pEGFp-BMI-1的HeLa细胞中存在荧光分布;Western blot检测发现存在外源性融合蛋白BMI-1-EGFp的表达。在HeLa细胞中过表达BMI-1显著下调p16ink4a mRNA的表达为对照组的9.2%(p<0.01)。结论:成功构建了真核表达质粒pEGFpBMI-1,转染HeLa细胞后可表达融合蛋白BMI-1-EGFp。这为今后研究BMI-1在肿瘤发生发展中的机制奠定了基础。