摘要：目的探讨在p19细胞诱导分化成心肌细胞过程中,桥粒芯胶蛋白-2(DSC2)基因沉默对其的影响。方法设计并合成针对DSC2基因编码区的干扰序列,构建真核细胞表达质粒并转染p19细胞。荧光定量聚合酶链式反应(RT-pCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)技术检测DSC2在mRNA和蛋白水平表达变化,筛选出沉默效率最佳的细胞株。二甲基亚矾诱导分化为心肌细胞,观察其超微结构和细胞凋亡等改变,以及对纤维化与脂肪化相关基因mRNA水平表达的影响。结果成功构建了5种ShDSC2重组质粒,转染p19细胞并获得稳定转染细胞株,筛选出对DSC2基因mRNA水平(69.47%vs 0,p<0.01)和蛋白水平表达(65.62%vs 0,p<0.01)的抑制效率最显著的ShDSC2-613组,并成功诱导分化为心肌样细胞后,电镜扫描显示后者细胞出现脂滴、空泡样变性、线粒体肿胀及嵴消失,流式细胞仪检测提示细胞凋亡显著增加,RT-pCR示纤维化相关基因(Collal、Colla2、Col3a1)与脂肪化相关基因(Adiponectin、ppAR-γ、C/EBp-α)的mRNA表达均显著升高。结论建立能有效抑制DSC2表达的p19细胞株并分化为心肌样细胞,表现出与致心律失常型右室心肌病(ARVC)患者病理和分子生物学特点相似的表型特征,提示其可作为深入研究ARVC致病机制的前体细胞。

摘要：目的:构建小鼠NOMO1基因RNA干扰载体,比较其对p19细胞NOMO1基因的抑制效率,以研究NOMO1基因与p19细胞向心肌细胞方向分化的关系。方法:利用Designer3.0软件设计小鼠NOMO1基因干扰片段,合成shRNA序列,再行寡核苷酸双链的合成,退火后形成的寡核苷酸双链克隆到pGpU6/Hygro载体的黏性末端,连接产物转化到感受态细胞,增菌,质粒扩增,质粒DNA抽提,使用pstⅠ、BamHⅠ进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆。将小鼠NOMO1基因RNA干扰载体转染p19细胞,以RT-pCR技术验证NOMO1基因在p19细胞中的mRNA表达。以DMSO诱导分化方案诱导p19细胞向心肌细胞分化,采用定量RT-pCR技术检测p19细胞中α-MHC等基因mRNA的表达,评估NOMO1与p19干细胞向心肌细胞方向分化的关系。结果:双酶切证实shRNA正确插入质粒,测序结果表明插入的序列正确。载体转染的p19细胞筛选稳定表达株,经RT-pCR和Western blot验证4个位点设计的干扰质粒对NOMO1在p19细胞中的mRNA表达均具有较高的抑制效率。转染后p19细胞的α-MHC基因mRNA表达则显著下调(p<0.05)。结论:成功构建小鼠NOMO1基因RNA干扰载体,为研究NOMO1基因与p19细胞向心肌细胞方向分化的关系提供了稳定的转染细胞工具,NOMO1可能通过诱导α-MHC等基因表达,促进p19干细胞向中胚层的分化。

摘要：目的构建鼠miR-20b慢病毒表达载体,检测其在p19细胞中的过表达效果。方法设计并合成含有miR-20b成熟序列的编码短发卡状RNA(shRNA)的双链DNA。将shRNA克隆入慢病毒载体,与pcgvp、Rev和Vsvg包装质粒共转染HEK-293T细胞包装病毒,收取病毒上清液,纯化后感染p19细胞。荧光倒置显微镜下观察感染效率,实时定量pCR检测慢病毒感染后miR-20b的相对表达量。结果经双酶切分析及测序验证,成功构建了miR-20b的过表达载体。慢病毒感染p19细胞的效率可达到70%以上,miR-20b表达水平明显升高。结论成功构建了鼠miR-20b的慢病毒表达载体,包被的病毒可以在p19细胞中实现过表达效果。