摘要：为观察微小隐孢子虫p23基因真核重组质粒在He La细胞中的表达及免疫小鼠血清抗体产生情况,通过设计特异性引物,利用pCR技术,对微小隐孢子虫卵囊基因组DNA进行p23基因扩增;将扩增产物插入真核表达载体p VAX-1中,构建重组真核表达质粒p VAX1-p23,转染He La细胞,运用间接免疫荧光法及Western-blot技术,验证重组质粒在He La细胞中的表达情况;将重组质粒p VAX1-p23免疫小鼠,用间接ELISA检测小鼠血清特异性抗体产生情况。结果显示,成功地扩增了长度约为336 bp的微小隐孢子虫p23基因;双酶切和序列测定结果显示,构建的真核重组表达质粒p VAX1-p23中外源基因序列和插入位置正确;间接免疫荧光法及Western-blot分析显示,p VAX1-p23真核重组表达质粒在He La细胞中被成功表达;小鼠免疫重组质粒2周后,即可检测到抗体产生,直至第8周试验结束。结果表明成功地构建了真核重组表达质粒p VAX1-p23,该重组质粒能在He La细胞和小鼠体内表达,并诱导小鼠产生显著的体液免疫反应,为进一步开展隐孢子虫p23蛋白特性研究、研制抗隐孢子虫病核酸疫苗奠定了基础。

摘要：为将微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)p23基因在巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)系统中进行表达,利用表达蛋白初步建立隐孢子虫病间接ELISA诊断技术,设计引物从微小隐孢子虫基因组DNA中扩增p23基因序列,构建ppIC9K-p23重组质粒,在毕赤酵母中进行表达,用阴离子交换层析柱进行纯化。以重组p23纯化蛋白为抗原建立间接ELISA检测方法,对现场采集的猪血清样品进行检测。SDS-pAGE显示所表达的蛋白大小约为23 kDa。Western blot检测表明该蛋白能与兔抗p23蛋白血清特异性结合。用建立的间接ELISA技术对186份猪血清样品进行检测,阳性率为83.3%。本研究获得了真核表达的p23重组蛋白,初步建立了微小隐孢子虫病间接ELISA诊断技术,为隐孢子虫病的诊断和流行病学调查打下了基础。

摘要：为建立一种牛瑟氏泰勒虫快速检测技术,根据GenBank上已发表的牛瑟氏泰勒虫p23表面蛋白基因序列(D84447)设计1对特异性引物,扩增出大小为244 bp的基因片段,经克隆、测序分析,与已知基因序列同源性为100%。用该对引物建立的牛瑟氏泰勒虫二温式pCR能检测出的最高敏感度为171 fg/μL,与牛新孢子虫、弓形虫和卵形巴贝斯虫不产生交叉反应,对48份临床血液样本进行检测,阳性检出率为66.67%。用同一对引物对28份临床血液样本分别进行二温式pCR和三温式pCR检测,阳性符合率为95%,总符合率为96.43%。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异等优点,可用于牛瑟氏泰勒虫病的快速临床诊断及流行病学调查。