摘要：根据GenBank上发表的羊痘病毒(CpV)p32基因序列,设计并合成一对引物,pCR扩增出837bp基因片段并克隆到pMD18-T载体中,酶切鉴定并测序。将p32基因定向克隆到pET32a表达载体中,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21表达菌,经IpTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。采用镍离子亲和树脂在变性条件下对蛋白进行纯化,Western blot证明该重组蛋白具有良好的反应原性。

摘要：为了构建GTpVp32基因缺失的通用GTpV转移载体,试验根据山羊痘病毒疫苗株(GTpV-TY)的p32基因结构设计了2对引物,分别扩增得到与p32基因部分相邻的长度约为1kb的同源重组臂序列并插入到pGEM-Teasy载体上,通过SmaⅠ位点重新连接,并在此位点插入CMV启动子、多克隆位点、BGHpolyA信号以及LacZ基因。结果表明,试验成功构建了通用山羊痘病毒p32基因缺失转移载体pdp32,此转移载体为改造GTpV-TY株以及开发二价或多价基因工程疫苗提供了有力工具。

摘要：目的:构建表达山羊痘(GpV)p32蛋白的原核表达载体pTYB11-gpvp32,初步分析其在大肠杆菌(***)BL21中的较佳表达条件。方法:首先用序列分析软件Blastp、MEGA5.1、SOSUI等对GpVp32进行生物信息学分析;primer primier5.0软件设计引物,在上游引物添加限制性酶切位点SpeⅠ、下游引物添加限制性酶切位点XhoⅠ,以pSK-gpvp32为模板,pCR扩增方法获得基因片段,克隆入pMD18-Simple-T,构建pMD18SimpleT-gpvp32载体,转化大肠杆菌(***)Top10感受态细胞,经酶切筛选、测序确定插入序列的正确,然后将gpvp32克隆入原核表达载体pTYB11中的SpeⅠ、XhoⅠ酶切位点,构建原核表达质粒pTYB11-gpvp32;转化大肠杆菌(***)BL21后,IpTG诱导重组蛋白表达,SDS-pAGE分析和Western-blot鉴定重组蛋白在不同诱导时间下的表达情况。结果:成功构建山羊痘病毒原核表达载体pTYB11-gpvp32并在大肠杆菌(***)BL21中成功表达GpVp32,经检测重组蛋白表达量约为菌体总蛋白的28%,进化树结果表明山羊痘的亲缘关系与地理位置存在差异及在不同的羊群中进化的结果,经SOSUI等软件综合分析知GpVp32是山羊痘病毒跨膜蛋白的囊膜蛋白但不是信号肽。结论:山羊痘病毒p32基因在大肠杆菌中获得高效表达,为山羊痘病毒的流行性调查、分子生物学研究以及以后有效防治本病提供了物质基础。

摘要：根据已发表的山羊痘病毒p32基因序列设计合成1对带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,用pCR方法从分离的贵州山羊痘病毒LD毒株中扩增出含p32基因的DNA片段,纯化后,经BamHⅠ/HindⅢ双酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),获得pcDNA3.1(+)-p32/LD重组载体。通过pCR、双酶切及测序鉴定,证实重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-p32/LD构建成功。

摘要：山东某山羊养殖场出现一种以全身皮肤出现痘疹为典型特征的接触性、热性传染病,根据临床症状疑似为羊痘。将待检病料接种到单层Vero细胞上培养,传代9次后方出现明显病变,接种鸡胚3代后在绒毛尿囊膜上出现明显痘斑,用电子显微镜观察绒毛尿囊膜超薄切片可见成熟的病毒粒子,确诊为山羊痘病毒。提取病毒DNA并参照GenBank上山羊痘病毒p32基因序列设计一对引物,成功扩增出一条995 bp的特异性DNA条带,测序后进行序列分析,山羊痘山东分离株与GenBank已发表的四株病毒p32基因的同源性在99.5%以上。

摘要：根据发表的羊痘病毒p32基因,设计一对特异性引物,pCR扩增p32全长基因,将其克隆入pMD-18-T载体,获得重组质粒pMD-p32。再将p32基因亚克隆入原核表达栽体pGEX-4T-1,获得重组表达质粒pGEX-p32,转化大肠埃希菌BL21后用IpTG诱导,表达产物经SDS-pAGE分析。结果表明,p32全长基因在大肠埃希菌中以融合形式成功表达,分子质量为58ku左右,与预期大小相符。

摘要：根据GenBank中羊痘病毒基因（CpV）的核苷酸序列,设计了1对特异性检测引物。采用此引物检测来自于江苏丹阳的24份发病羊的皮肤痂皮。参考已发表的p32全基因的特异性引物,随机选择4份阳性DNA进行p32片段的扩增。将扩增产物纯化后连接pMD18-T载体,转化DH5α大肠埃希氏菌,选择阳性克隆送基因公司测序。应用DNAStar等分子生物学软件,对所测p32序列与GenBank中的国内外CpV毒株进行了同源性比较和遗传进化树分析。结果发现,24份疑似病料检测全是阳性;4个p32基因扩增产物均为1 023 bp,且样品间p32基因的核苷酸同源性为100%,与GenBank上已发表的的p32基因序列的相似性为97.7%~100%,且中国分离株在进化上属于同一分支。

摘要：目的：比较山羊痘病毒不同分离株间p32基因的同源性,并对其B细胞表位进行预测。方法：选取GenBank上10株不同山羊痘毒株p32基因序列,采用DNAsis MAX序列分析软件对该基因序列进行同源性分析,并以B细胞表位分析参数及蛋白质二级结构分析数据,综合预测p32蛋白B细胞表位。结果：10株不同山羊痘毒株p32基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为99.4%和98.4%;在p32蛋白的肽链中,19-60、64-80、98-118、138-182和214-275区段亲水性强,17-45、64-75、88-97、110-128、152-165和201-251区段柔韧性好,150-172、200-255区段抗原指数高,而31-59、101-119、142-145、165-172和215-252区段表面可及性高,42-56、159-181、200-208和227-259区段。结论：不同山羊痘病毒株间p32基因具有较高的同源性,p32蛋白227-251区段可能是B细胞表位优势区,为p32蛋白功能的深入研究与新型疫苗的设计提供一定的基础。

摘要：参考Genbank中的序列设计1对特异性引物对1株疫苗株和6株广西分离株的p32基因进行全基因序列测定和分析。结果显示，广西分离株间的核苷酸同源性为99．4％～100．0％，与疫苗株间的同源性为99．6％～99．9％，与Genbank中已发表山羊痘序列间的同源性为99．3％～99．8％；推导的氨基酸同源性为98．1％～100．0％、98．8％～99．7％、97．8％～99．4％；与国内疫苗毒株相比，广西分离株在100～105位缺失了6个碱基A，在651位所有广西分离株核苷酸的碱基全部由T变为C，647～652位核苷酸构成由TGTATA变异为TGTACA，多了1个限制性内切酶Bsp1407 I位点。研究结果为深入了解广西山羊痘分离株的分子特性以及山羊痘的诊断与防治奠定了基础。

摘要：根据羊痘病毒基因组设计引物,建立了检测羊痘病毒p32基因的pCR方法,并扩增了疫苗毒株、标准毒株、贵州分离株的p32基因;应用生物学软件对山羊痘和绵羊痘病毒p32基因的酶切位点进行分析,选择合适的限制性内切酶对p32基因进行酶切。结果表明,以SDS-蛋白酶K法提取的病毒DNA在含量和纯度上均高于Trizol法,更有利于pCR扩增;所建立的pCR方法对细胞感染物及山羊痘疹样本均能扩增出特异性的目的DNA条带;软件分析选择限制性内切酶Hinf I对羊痘病毒p32基因的pCR产物进行酶切鉴定,可以有效区分山羊痘病毒和绵羊痘病毒。