摘要：为快速检测牛支原体(***),根据GenBank中登录的*** p81基因序列设计特异性引物,通过条件优化,建立了***环介导等温扩增(LAMp)检测方法。将该方法的灵敏度与巢式pCR进行对比,并用其检测牛支原体外的其他几种病原菌,同时对疑似感染***的临床病料进行检测。该方法的灵敏度比巢式pCR高103倍,最低检出限为1.1ng/L,对其他几种病原菌的检测结果均为阴性,临床病料检测结果与分离培养符合率为100%。建立的*** LAMp检测方法灵敏度高、特异性强、检测快速准确,且不需要专门的仪器设备,可用于牛支原体病的临床检测。

摘要：本研究对我国采集自8个省份患有牛呼吸道疾病的肺脏组织病料进行了病原分离鉴定,得到8株牛支原体(***)分离株。参考GenBank中已发表的***45株的p81基因序列,设计引物扩增p81基因,将其克隆到pMD-18T上,筛选重组质粒并对其进行序列测定及分析。结果显示,p81基因全长2097bp,含有1个开放性阅读框,编码699个氨基酸。这8株***分离株的p81同源性为99.4%～99.9%,与pG45株同源性94.6%～94.9%,与无乳支原体(***)pG2株同源性仅为73.8%～74%,结果表明,***81基因基因高度保守,种间差异较大,具有研究前景。

摘要：目的重组表达牛支原体p81膜蛋白,为研制牛支原体疾病诊断试剂提供研究基础。方法根据GenBank发表的牛支原体p81基因的编码序列,利用点突变试剂盒基于重叠延伸pCR原理设计5对引物,将p81基因的第165、690、1 455、1 674位编码色氨酸的TGA密码子分别突变为TGG,并连接到表达载体pET-32a(+),转化DH5α感受态细胞后经IpTG诱导表达目的蛋白,Western blot检测其反应原性。结果成功扩增出4处TGA突变为TGG的牛支原体新疆分离株p81基因,大小与预期值2 112bp一致。重组表达载体转化菌经IpTG 37℃诱导8h,表达分子质量单位(Mr)约94×103的目的蛋白,与预期相符。Western blot检测该蛋白能被抗p81多克隆抗体识别。结论成功构建重组牛支原体p81膜蛋白基因表达载体,获得的目的蛋白具有良好反应原性,为研发牛支原体病免疫诊断试剂奠定了基础。