摘要：用单因素法研究马尾松EST-SSR pcr体系中各成分及退火温度对扩增结果的影响。结果显示优化后的反应体系为:2μL 10×Buffer(Mg2+Free),30 ng模板DNA,0.187 5 mmol/L-1 dNTPs,3.75 mmol·L-1 Mg2+,8 pmol引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,加水至20μL。退火温度为56℃。并用21个马尾松DNA检验这一优化体系。检测试验表明,优化后的EST-SSR pcr反应体系稳定、可靠、可重复性强。

摘要：本实验通过建立CYP2C19*2、*3和*17基因多态性pcr反应体系和条件,筛选出4μL体系中各因素最佳水平。采用SNaPshot技术对CYP2C19基因3个SNP位点*2、*3和*17同时进行复合扩增检测,利用L9(34)正交实验设计,对影响pcr反应体系和条件的3个因素(pcr Mix, Taq DNA聚合酶,循环次数)在3个水平上进行优化,结果采用综合评分法和极差分析法进行分析。用3组已知样本对正交优化所得条件进行重复性和稳定性验证。结果表明CYP2C19*2、*3和*17基因pcr扩增体系的影响因素依次为:pcr Mix>循环数>Taq DNA聚合酶。最佳反应体系为pcr Mix 2.0μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、循环次数32次。3组样本验证效果满意。优化的CYP2C19*2、*3和*17基因pcr反应体系稳定性高,重复性和经济性较好,为该基因多态性的大规模调查奠定了基础。

摘要：小麦高分子量谷蛋白14亚基(HMW-GS1Bx14)被认为可能对面团加工品质有很大贡献的亚基.为了验证其功能,本研究欲通过pcr方法扩增14亚基基因,并使其在大肠杆菌中大量表达,为下一步用掺粉实验验证其功能奠定基础.但是由于HMW-GS1Bx14基因由2388bp个碱基组成,GC含量较高,并且在基因中包含约1.6kb的重复区,所有这些都使常规pcr难以成功扩增出HMW-GS1Bx14基因.本研究采取以下三种措施①设计一对高Tm值的特异引物;②采用二段法pcr反应程序;③改良pcr反应的缓冲体系、添加有机溶剂(DMSO,甜菜碱等)和Taq酶保护剂(BSA等);最后成功地扩增出目的片段.此外由于不同生物间对密码子使用存在很大差异,因此HMW-GS1Bx14基因很难在大肠杆菌中得到有效大量的表达.本研究选用万能菌株Rosetta(DE3)plysS作为表达用菌,从而克服了不同生物间密码子使用偏爱性的问题,成功的使HMW-GS1Bx14得到表达,为下一步研究HMW-GS1Bx14的基因功能奠定了基础.

摘要：细菌是微生物的重要组成部分,其对保持湿地生态系统平衡起着重要作用,在沉积物细菌T-RFLP(terminal restriction fragment length polymorphism)分析中建立与优化pcr体系对进一步研究沉积物细菌群落组成具有重要意义。此次研究以松江湿地沉积物细菌基因组DNA为模板,采用正交和单因素试验对pcr体系中各因素(模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶)进行优化,系统分析各因素对pcr扩增结果的影响,建立最佳pcr反应体系。在20μL反应体系中,DNA模板30 ng、Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.2μmol/L、Taq酶0.5 U。该优化体系确保了沉积物细菌T-RFLP分析过程中pcr产物的质量与效果。

摘要：目的建立通用的CYP2C19*2和CYP2C19*3基因pcr反应体系,筛选出各反应因素的最佳水平,并确定最佳退火温度。方法采用正交设计L16(45)在4个水平5个因素(Taq酶、引物、Mg2+、dNTP和模板DNA)对CYP2C19*2和CYP2C19*3基因pcr反应体系进行实验,两次结果分别用统计软件MINITAB进行分析,利用梯度pcr确定引物最佳退火温度。结果 CYP2C19*2和CYP2C19*3基因pcr反应的最佳反应条件为25μl体系中包含:Mg2+(25 mmol/L)1.0μl、dNTPs(2.5 mmol/L)2.0μl、上游引物和下游引物(2.5μmol/L)各1.5μl、模板DNA约30 ng、10×pcr缓冲液2.5μl、Taq酶2 U、染料2.0μl,退火温度为55℃。结论建立了CYP2C19基因多态性检测方法的通用pcr反应条件。

摘要：目的建立通用的ALDH2基因pcr反应体系,筛选出各反应因素的最佳水平。方法采用正交设计L16(45)在4个水平5个因素(Taq酶、引物、Mg2+、dNTP和模板DNA)对ALDH2基因pcr反应体系进行实验,两次结果分别用统计软件MINITAB进行分析,利用梯度pcr确定引物最佳退火温度。结果 ALDH2基因pcr反应的最佳反应条件为:为25 L体系中包含:Mg2+(25 mM)2.5 L、dNTPs(2.5 mM)2.0 L、引物上游和引物下游各(2.5 M)3.0 L、模板DNA 3.0μL、10×pcr buffer 2.5 L、Taq酶1.5U,退火温度为60℃。结论这一通用pcr反应条件的建立为实现ALDH2基因多态性检测建立了基础。

摘要：目的:构建哈蟆油药材真伪可视化鉴定的方法,尝试解决哈蟆油药材的鉴别难题。方法:根据改良SDS法,提取哈蟆油DNA。根据GenBank下载中国林蛙基因序列,设计并筛选出特异性最佳的引物;构建蛙类通用引物与特异性引物的pcr双重体系;利用荧光素及生物素标记特异性引物,评价试纸条可视化检测核酸产物的可行性。结果:成功设计并筛选出哈蟆油特异性引物,构建了双重pcr体系。利用标记成功的特异性引物成功构建了核酸产物可视化试纸条,在10 min左右可观察检测结果。通过大量实验样本验证了该种方法的特异性及稳定性。结论:该研究利用核酸产物试纸条进行哈蟆油药材的真伪鉴定,为哈蟆油的快速鉴定提供新的思路和新的方法,同时也具有较高的推广和应用价值。