摘要：参照国内外已发表的禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)的基因序列和AIV相关的RT-pcr检测方法,根据AIV高保守、高特异的M蛋白基因设计了一套通用型引物,通过对相关病毒、棉拭子检测,建立了AIV通用型RT-pcr检测方法.根据AIV HA基因设计了H5、H7、H9亚型的联合RT-pcr引物,其上下游引物分别位于裂解位点两侧,在确定各亚型单项RT-pcr检测方法的反应条件和反应体系的基础上,建立、优化了三联RT-pcr检测方法的反应体系和反应条件,并通过相关病毒、质粒、棉拭子检测,建立了AIV三联RT-pcr检测方法.最终建立了AIV系列RT-pcr检测方法,该方法具有快速、敏感、特异等优点,为AIV检测、流行病学调查、致病性分析及疫苗使用等奠定了基础.

摘要：目的利用TaqMan pcr技术,建立乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)实时荧光pcr检测方法,初步应用于蚊虫媒介的JEV监测。方法根据GenBank发表的JEV全基因组序列资料分析结果,在其NS5基因区段设计JEV特异的引物与探针;优化Mg2+浓度和引物浓度比例,并利用11株JEV和7株相关病毒株考核检测体系的保守性、特异性、灵敏性和稳定性;利用体外转录的病毒RNA和定量的病毒样品,建立相应的定量分析模型;初步应用于蚊虫媒介的监测与检测分析。结果Mg2+优化浓度为5mmolL,上下游引物浓度比例为4∶1,引物探针具有良好的保守性和特异性,灵敏度为10PFUml,稳定性分析表明,同一样品Ct值的重复检测5次,变异系数均小于5%;绘制两种标准曲线,构建了JEV基因拷贝数、病毒滴度为分析指标的定量分析模型,检测蚊虫标本结果显示,TaqMan pcr方法较病毒分离法敏感、快捷、简便。结论本研究建立了一种灵敏、特异、简便易行的JEVTaqMan pcr检测方法,为蚊虫媒介检测奠定了基础,为乙型脑炎的预防控制和脑炎相关疾病的诊断与鉴别诊断提供了一种技术手段。

摘要：从 12头疑似产气荚膜梭菌感染的猝死警犬中分离获得了 18株病原菌 ,经生化试验及毒素中和试验 ,确定为A型和C型产气荚膜梭菌。参考GenBank中登录的基因序列 ,设计合成了针对产气荚膜梭菌α、β、ε、ι、CPE和 β2共 6对分型毒素基因的引物 ,对以前昆明地区分离的 1株产气荚膜梭菌进行了pcr扩增 ,结果扩增出了与预期大小相同的 6个基因片段 ,分别为 2 33、196、32 4、4 46、5 6 7和 6 6 5bp。建立的pcr方法能同时用于产气荚膜梭菌鉴定和毒素分型 ,较细菌毒素检测方法快速 ,与细菌分离鉴定的结果一致。

摘要：根据已发表的鸡痘病毒 (fowlpox virus,FPV) 4 b核心蛋白基因的核苷酸序列设计合成了 2对引物 ,通过对影响pcr扩增因素的优化 ,2对引物在同一反应条件下 ,以抽提 FPV DNA或直接用其毒液制备的模板均能分别扩增出预期的 5 4 9、136 1bp的片段。特异性检测表明 ,2对引物对 FPV10 2株、FPV2 82 E4 (北京 )、FPV2 82 E4 (吉林 )、v FV2 82重组鸡痘疫苗毒及 FPV临床分离株均能扩增出相应特异性片段 ,而用鸡马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、羊痘病毒、鸡胚成纤维细胞 (CEF)制备的模板分别进行 pcr扩增却成阴性。敏感性检测表明 ,2对引物 (p1 ,2 、g1 ,2 )分别能检测到 10 - 2 、10 - 3fmol的 FPV DNA和 10 0 .5、10 - 0 .5TCID50 的病毒。以上结果表明 ,本试验所建立的 FPV pcr检测法具有较高的特异性和敏感性 ,模板制作简单 ,完全可用于

摘要：【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪圆环病毒2型(PCV2)的SYBR-Green 1实时荧光定量pcr方法。【方法】根据已报道的PCV2ORF2基因组序列,设计并合成1对引物。通过常规pcr扩增PCV2ORF2基因,将鉴定正确的ORF2基因片段克隆入pTG19-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经pcr及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR-Green 1荧光定量pcr标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】PCV2荧光定量pcr标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.9988,最低检测的拷贝数为1拷贝/25μL,特异性和重复性较好。【结论】建立了检测PCV2的SYBR-Green 1荧光定量pcr方法,为该病的早期诊断及定量分析PCV2感染程度奠定了基础。

摘要：根据猪胸膜肺炎放线杆菌 (Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的 apx A基因序列设计了 1对可扩增 1个4 2 2 bp片段的特异性引物 ,成功地建立了一种检测 APP的快速 pcr方法 ,并确定了其特异性和灵敏性。对血清 1～ 13型等 13个 APP标准株均能扩增出预期 4 2 2 bp的特异性条带 ;对猪副嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌的扩增结果为阴性。对 APP菌液最低检出浓度为 6 8CFU/ m L(D6 0 0 为 0 .0 0 3)。 12株临床分离菌的 pcr扩增结果与生化鉴定结果是一致的。该方法能从病料中分离培养 8h的混合菌群中快速检测APP,可用于 APP的快速诊断和流行病学的调查。

摘要：建立了一个可以识别丝状支原体丝状亚种SC生物型 (MmmSC)的pcr方法。根据丝状支原体丝状亚种SC生物型(MmmSC)相关核苷酸序列 ,设计合成了MC1、MC2和SC1、SC2两对引物。MC1、MC2是一对簇特异性引物 ,用于鉴别丝状支原体族 6个成员 ,对MmmSC、MmmLC扩增出与预期结果相符的 4 6 2bp片段 ;而SC1、SC2是针对MmmSC的一对特异性引物 ,只能对MmmSC扩增出 2 77bp的片段 ,经过VspI、Bsp14 3I和Dral三种限制性内切酶鉴定与预期结果相符 ,而不能扩增出MmmLC型Y_goat代表株 ,说明具有非常好的特异性。对MmmSC进行的敏感性试验显示SC1、SC2引物能够检测到 10 0个CFU ,具有非常高的敏感性。

摘要：参考Genebank发表的西尼罗热病毒(WestNilevirus,WNV)E糖蛋白基因序列,自行设计合成一对引物,对WNV进行RT-pcr扩增,产物经琼脂糖电泳分析,呈现一条约400bp的条带,将其克隆入pMD18-T-Vector载体中,并进行序列测定,与已发表的WNV基因比较发现,核苷酸的同源性为99.7%,证实为WNV的E基因,通过对样品多次检测,都能扩增出一条约400bp的条带,表明该方法比较稳定。

摘要：根据基因库中单孢子虫的基因保守序列,设计了1对特异性引物,通过对pcr扩增条件的优化,建立了检测贝类单孢子虫的pcr方法。用该方法对单孢子虫模板进行扩增,得到与试验设计相符的244 bp的特异性条带,而对派琴虫、折光马尔太虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的扩增结果全为阴性。敏感性试验结果表明,该方法最低能检测到100 fg的单孢子虫DNA。

摘要：根据已报道的马动脉炎病毒基因组保守基因核苷酸序列,设计并合成了1对引物,通过对影响pcr扩增因素的筛选,成功地从病毒感染的细胞中扩增出约200bp的片段,与理论设计值(204bp)大小一致。而正常的RK-13、BHK-21和Vero细胞和同为动脉炎病毒科的猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV)作为对照的扩增结果均为阴性。敏感性试验表明,该方法可以检测出10-4个TCID50的病毒含量,说明具有较好的敏感性。