摘要：根据GenBank登录的猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(pcv2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的参考基因序列,设计3对引物分别用于扩增pcv2的ORF2基因、PRV的gE基因、PRRSV的N基因的目的片段,通过优化反应中各个影响因素,建立了PRV、pcv2、PRRSV的多重PCR(mPCR)检测方法。敏感性和特异性的结果表明,该方法对这3种病毒的最低核酸检出量分别为32.5(PRV)、25.2(pcv2)、35.9pg(PRRSV)。该方法对猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒1型(pcv1)、大肠杆菌、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(TGE)等病毒的检测结果均为阴性。200份临床样品的多重PCR结果表明,pcv2感染率为80%(160/200),PRV感染率为21%(42/200),PRRSV的感染率为78%(156/200)。200份临床样品主要为pcv2和PRRSV混合感染,阳性率达56.0%(112/200)。该方法的建立对这3种病毒病的早期快速检测和指导临床实践具有十分重要的意义。

摘要：旨在获得MRC1基因修饰的pcv2靶细胞并在体外验证该细胞对pcv2的抑制作用,为后续基因编辑猪的生产提供理论基础。本研究:1)首先利用基因工程技术建立了慢病毒介导的高效同源重组载体和CRISPR/Cas9基因靶向系统;2)通过细胞和分子生物学技术筛选了定点整合表达MRC1的PK15细胞系;3)随后通过细胞试验和pcv2的攻毒试验对其抗pcv2的作用进行了相关验证。结果:1)成功构建了含有红色荧光标记基因、嘌呤霉素标记基因、同向LoxP序列和多克隆位点的pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP载体,同时根据不同猪品种间MRC1基因启动子差异序列设计同源臂,成功构建同源重组载体和靶向同源臂的CRISPR/Cas9基因靶向载体;2)通过病毒包装和共转染的方法,利用嘌呤霉素筛选并验证了MRC1启动子基因编辑的PK15细胞株,成功将MRC1基因转录起始位点上游多出的14 bp敲入到PK15细胞中;3)随后对基因编辑的PK15细胞系进行抗病毒验证,MRC1基因编辑的PK15细胞株MRC1的蛋白表达量显著增高(P<0.05),同时显著降低了pcv2的复制(P<0.05)。MRC1启动子编辑的PK15细胞中MRC1蛋白表达量显著增高,该位点可以用于抗pcv2猪的制备。

摘要：拟测定在pcv2ORF2Cap P1多肽抗原中添加从pcv2ORF1、ORF3中筛选的Th细胞表位多肽在促进其免疫原性中的作用,以及合成表达的pcv2ORF2Cap P1多肽抗原作为疫苗抗原的可行性。采用生物信息学及分子生物学方法,筛选获得1条泛宿主新型Th细胞表位多肽和3条pcv2特异的含有Th细胞抗原表位的多肽序列,然后将这4条Th细胞多肽氨基酸序列与筛选自ORF2Cap1上的1条B细胞表位多肽序列进行串联组合,密码子优化,插入酶切位点、终止密码子,然后进行密码子适应指数和分布频率分析,预测可以实现高效表达后再进行化学合成。合成的P1多肽抗原连接到pET-30a表达载体,并转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,构建表达工程菌BL21(DE3)pLysS-pET-30a-P1。经IPTG诱导表达后P1可实现高效表达,SDS-PAGE鉴定表达量,Western Blot鉴定其生物活性,然后分别免疫小鼠和猪,测定小鼠免疫后的抗体水平以及猪免疫后P1合成多肽抗原对外周血淋巴细胞的刺激增殖情况。结果表明,设计合成表达的pcv2P1多肽抗原序列,密码子适应性指数为0.89,能够实现高水平表达,目的片段大小约为28.29ku,具有良好的免疫原性;MTT试验结果表明,P1多肽抗原免疫后机体内IFN-γ和IL-4的表达量明显增加,且与对照组差异显著(P<0.05)。这说明P1能够诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应,为其作为疫苗用抗原的进一步研究奠定了理论基础。

摘要：[目的] 了解目前四川省猪圆环病毒2型（pcv2）的分子流行病学特征和遗传变异情况,探讨pcv2感染的控制对策。[方法] 根据GenBank中发表的pcv2基因组序列设计2对特异性引物,对2012-2014年临床送检的pcv2感染病例材料中的5株pcv2全基因组序列进行扩增测序,并利用DNAStar等生物信息分析软件对获得的pcv2基因组序列进行分子特性与遗传演变分析。[结果] 5株pcv2四川株全基因组序列长度都为1 767bp,均具有滚环复制起点（ORC）典型结构。序列比对和进化分析显示,5株pcv2四川株的基因序列同源性很高,基因组核苷酸序列及ORF1、ORF2和ORF3基因序列同源性分别为98.4%～99.9%,97.5%～99.6%,99.4%～100%和96.2%～100%,ORF1、ORF2和ORF3基因推导氨基酸序列同源性分别为98.4%～99%,99.6%和91.5%～100%;与47条参比pcv2毒株核苷酸序列的同源性比较发现,5株pcv2与国内一些新出现的pcv2毒株亲缘关系较近,且均属于pcv2d基因型毒株。[结论] 5株pcv2四川株之间尽管存在着不同程度的基因变异,但遗传进化相对较稳定。

摘要：为建立可以同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(pcv2)的快速、敏感的检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的CSFV、PRRSV、PRV和pcv2 4种病毒的基因序列设计引物和探针,建立了一种能够用于同时检测这4种病毒的多重荧光定量PCR方法,并对其反应条件进行优化。结果显示,4种病毒的标准曲线相关系数均达到0.98以上,具有良好的线性关系。对CSFV、PRRSV、PRV和pcv2以外的其他病毒株核酸扩增均呈阴性,具有较强的特异性。灵敏度试验结果显示,该方法对这4种病毒的最低检测量均能达到10拷贝/μL。此外,该检测方法的批内和批间重复性试验变异系数均小于5%,表明所建立的方法具有很好的重复性。利用建立的方法对59例疑似猪繁殖障碍疾病样本进行检测,结果显示,单一病毒感染样本7例,阳性率为11.86%;2种或3种病毒混合感染阳性率为44.07%(26/59);无4种病毒同时感染的样本。以上结果表明所建立的检测方法具有快速、准确、特异性好、灵敏度高等特点,能够对CSFV、PRRSV、PRV和pcv2病毒同时进行检测,可以用于相关疫情的监测及防控。

摘要：Cap蛋白作为猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,pcv2)的重要结构蛋白,可以实现诱导机体免疫保护。以本实验室分离保存的pcv2毒株的Cap基因作为模板,设计特异性引物进行PCR扩增,并将该PCR产物连接至原核表达载体pET-28a上,获得重组质粒pET-28a-pcv2 Cap。将验证正确的菌种接入HB-pET自诱导培养基,过夜培养,SDS-PAGE及Western blot验证其表达,可获得28000左右的目的蛋白。利用亲和层析技术纯化pcv2 Cap蛋白,免疫BALB/c小鼠获得小鼠阳性血清,通过ELISA方法检测其效价,并用Western blot验证其活性。结果显示,本试验成功应用大肠杆菌表达了pcv2 Cap蛋白,表达的蛋白具有免疫原性,并获得小鼠阳性血清,为pcv2 Cap蛋白的功能研究、鉴定、抗体及疫苗研制和病原检测奠定理论基础。

摘要：目的针对猪圆环病毒（pcv2）特点,利用TaqMan探针建立一种能够快速、准确并具有临床应用价值的pcv2检测方法。方法参照GenBank已收录pcv2ORF2,利用软件设计合成1对特异引物以及与之相匹配的特异性TapMan探针,采用PCR对pcv2衣壳蛋白部分基因进行克隆并鉴定,将纯化回收产物连接至pMT19-T载体,然后转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞,涂布至Amp＋琼脂平板,筛选阳性克隆并扩大培养,进行2%琼脂糖凝胶电泳鉴定并测序。采用矩阵法确定引物和探针最佳浓度。对基于TapMan探针的实时荧光定量PCR循环进行优化,筛选最佳退火温度。以100-109倍稀释的标准品为模板,进行敏感性试验。提取CSFV、PRRSV、PRV和pcv1的DNA（CSFV和CSFV在提取RNA后反转录成cDNA）作为模板,进行TapMan荧光定量PCR,检测其特异性。采用105-108倍稀释的标准品为模板进行重复性实验,其中批内和批间均重复4次,根据所得值计算变异系数。结果 PCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后大小为114bp,与预期相符;测序分析PCR产物序列与参考序列同源性为100%。优化的PCR条件为：引物和探针浓度为10μmol/L,退火温度60℃。建立了pcv2TaqMan实时荧光定量PCR检测标准曲线,起始模板拷贝数为38.403,斜率为-3.69,相关系数R2为0.998,曲线呈线性。检测方法的敏感性为102拷贝/μl质粒标准品,是常规PCR检测敏感性的100倍。特异性检测显示,CSFV、PRRSV、PRV和pcv1扩增反应均阴性。重复性检测显示,PCR扩增循环阈值平均值基本一致,其变异系数均小于2%。采用TaqMan荧光定量PCR方法检测40份样品14份阳性,阳性率35.0%;普通PCR检测11份阳性,阳性率27.5%,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论建立的pcv2TaqMan实时荧光定量PCR检测方法具有以下优点：1）敏感性高,能够用于精确计算pcv2病毒载量;2）特异性强,适用于检测pcv2与其他病原混合感染;3）用时短且可靠性强,可用于pcv2感染检测。

摘要：pcv2和PRRSV是影响猪瘟防疫中最重要的免疫抑制因素。以1∶32为免疫抗体合格率,两毒自然感染猪,用2倍量的猪瘟脾淋苗,于30日龄首免、44日龄二免,72日龄时用4倍量强免,经87日龄、102日龄采血检测,其抗体合格率仍为零。若以pcv 2型灭活疫苗和猪蓝耳病灭活疫苗对仔猪进行免疫保护,即可明显提高猪瘟免疫合格率至90﹪以上。基于两病毒对猪瘟弱毒疫苗的免疫抑制作用,设计以猪瘟免疫抗体反应为指示系统:用免疫球蛋白pcv2-PRRSV-RRPSV-Ig G和猪瘟苗对仔猪进行免疫,在猪瘟疫苗末免3周后采血检测,其抗体合格率达到100%。

摘要：根据GenBank上猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)和猪圆环病毒2型(pcv2)的已发表序列,分别设计并合成了3对特异性扩增引物,建立CSFV、PRRSV和pcv2单项PCR检测方法,分别扩增出预期的466 bp、202 bp和706 bp片段。在优化单项PCR反应条件基础上,建立了CSFV-PRRSV-pcv2多重PCR检测方法,为预防和控制上述三种病毒性传染病提供了一种快速、敏感、特异的检测方法。

摘要：根据已发表的基因序列 ,选取 pcv2保守的基因片段 ,利用计算机软件设计的一对引物对某猪场的 7只患病仔猪的全血、血清、尿液、和粪便进行 PCR扩增 ,再对扩增产物酶切鉴定 ,并将 PCR产物连接到 p MD1 8-T载体上 ,然后转化到大肠杆菌 DH5α感受态细胞中 ,抽提重组质粒 ,对重组质粒 pcvp MD1 8进行 PCR、酶切鉴定及测序。结果表明 :全血、血清、尿、粪便阳性率分别为 85.7% (6/7)、71 .4% (5/7)、42 .9%(3 /7)、2 8.6% (2 /7)。通过比较 ,全血的阳性率最高 。