摘要：本研究利用整合素促进的靶蛋白溶酶体降解策略,设计合成了识别整合素受体αvβ3的小分子Gua-Azide以替代c(RGDyK)环肽,通过连接子使其与pd-l1抑制剂BMS-8相连,形成双功能小分子降解剂.该降解剂能够通过内吞-溶酶体途径靶向降解细胞膜上的pd-l1靶标蛋白,为开发癌症免疫治疗相关小分子药物开辟了新途径.

摘要：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在pd-l1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有pd-l1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对pd-l1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成双链后连接至lenti-V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证。对于正确的lenti-V2-sgRNA重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率。根据靶点位置设计左同源臂+GFP+右同源臂序列合成Donor片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证。将验证成功的lenti-V2-sgRNA和pUC19-donor-GFP共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP表达情况,菌落PCR及基因测序验证GFP报告基因的靶向插入效果。经酶切和测序鉴定,靶向编辑pd-l1的Cas9载体lenti-V2-gRNA和含GFP基因的Donor质粒pUC19-donor-GFP构建成功。两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察、多克隆验证、单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP成功转入HT29细胞并进行了表达,经有限稀释法筛选出的单克隆细胞荧光均一,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR均检测到特异条带,表明在pd-l1终止密码子前成功插入了GFP片段,细胞株构建成功。通过基因编辑技术成功构建了稳定表达pd-l1-GFP报告基因的HT29结肠癌细胞株,建立了一个可以直观在细胞上观察pd-l1是否表达以及表达的强弱程度的系统,为后期体内外筛选调控pd-l1的上游新靶点及药物奠定了基础。

摘要：目的:核因子E2相关因子2 (NRF2)是一种转录因子,在多种肿瘤类型中发挥着双重作用。本研究旨在研究NRF2在胃癌中的表达情况,明确其在免疫疗法中的预后意义,并探索其与免疫细胞浸润之间的关联。方法:我们采用PCR技术探究NRF2与pd-l1在转录水平上的调控关系。并对在2020年1月1日至2022年12月31日期间在青岛大学附属医院接受一线治疗的晚期胃癌患者进行筛选,收集了相关患者的胃镜或手术标本,通过免疫组化方法检测NRF2的表达水平。我们评估了不同表达水平患者的一线无进展生存期。此外,利用TIMER和TISIDB数据库,我们评估了NRF2的差异表达以及其与免疫微环境的关系。结果:研究发现NRF2与pd-l1在转录水平上存在明显的正调控关系。在青岛大学附属医院接受治疗的患者队列中,我们观察到NRF2表达升高的病例中,相对于化疗,免疫疗法表现出更佳的疗效。此外,在线数据库分析显示NRF2表达与免疫微环境之间存在显著相关性。结论:NRF2通过调节pd-l1可能在免疫相关过程中扮演关键角色,因此对指导胃癌患者的免疫疗法具有重要意义。该研究为设计新型靶向药物提供了深刻的见解。

摘要：目的:探讨不同保存时间对血浆胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)及肿瘤相关蛋白pd-l1表达的影响。方法:使用离心和免疫吸附的方法,选取回顾性研究常用的-80℃存放1个月、1年、3年、5年的血浆EVs与新鲜血浆EVs进行对比;使用透射电镜对提取的EVs的形态进行观察;用NTA检测各组EVs的大小及数量;用ElISA试剂盒测定EVs上肿瘤标志性蛋白pd-l1的表达情况。结果:不同存储时间的血浆总蛋白水平及平均粒径大小无显著差异。而保存时间超过1年,EVs形态出现变形、聚集和碎裂等变化。随着保存时间的延长,EVs上的标志性蛋白CD63逐年减少。保存3年和5年的样本中肿瘤标志蛋白pd-l1水平明显降低。结论:存储时间对EVs表面蛋白及肿瘤标志蛋白影响较大。在以EVs为对象的研究中,需尽量采用随访设计,提取新鲜的血浆样本进行检测。在回溯性研究中,尽量选取样本库中保存一年以内的样本进行检测。

摘要：本研究设计合成了28个全新12N取代苦豆碱衍生物并测定其在乳腺癌细胞MDA-MB-231中下调pd-l1水平的活性。其中,化合物7f具有较高的下调pd-l1活性,呈时间和剂量依赖性,且显示出较低的细胞毒性。7f可浓度依赖性地激活共培养T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性,显示出肿瘤免疫治疗的潜力。进一步研究显示, 7f可能通过溶酶体途径介导pd-l1的降解。该研究为苦豆碱类化合物发展为一类全新小分子肿瘤免疫抑制剂提供了有益的指导。

摘要：目前已有多款细胞程序性死亡受体1(pd-1)和其配体(pd-l1)免疫检查点阻断抗体用于临床治疗,但只有部分患者表现出临床反应,因此需要一种替代的肿瘤免疫治疗策略。以pd-l1为靶点的治疗性肿瘤疫苗是一种有意义的尝试。本研究设计了以pd-l1为靶点的表位肽疫苗,然后基于人源化免疫系统(HIS)小鼠模型筛选,具有免疫原性的pd-l1表位肽,进一步研究其抗肿瘤活性。结果显示,设计并筛选得到的pd-l1-B1表位肽疫苗不仅成功诱导了pd-l1特异性的体液免疫和细胞免疫,还表现出抗肿瘤活性。此外,免疫治疗还增加了肿瘤的T淋巴细胞浸润,重塑了肿瘤免疫抑制微环境。综上所述,pd-l1-B1表位肽疫苗表现出强效的抗肿瘤活性,对pd-1/pd-l1阻断不敏感的患者可能是一种有效的替代免疫治疗策略。

摘要：目的:探讨干扰pd-l1(programmed death 1-ligad)的表达对抑制小鼠B细胞淋巴瘤的作用。方法:针对C D274(pd-l1)靶基因序列,设计3个RNA干扰靶点序列,连接到pGMVl-SC5干扰载体,瞬时转染293T细胞。RT-q PCR检验各靶点对pd-l1的干扰效率,将干扰效率最佳的shRNA载体进行慢病毒包装,转染A20细胞,获得稳定低表达pd-l1的A20淋巴瘤细胞株(CD274-sh A20),将A20细胞株和CD274-sh A20细胞株以等数体外培养48 h,MTT法比较体外增殖的差异;同时使用2株细胞分别对免疫功能正常的BAlB/c小鼠进行荷瘤,对照组皮下注射等体积PBS缓冲液;通过活体荧光成像评估成瘤情况,记录各组小鼠生存期。结果:CD274-sh A20细胞体外增殖速率显著低于pd-l1高表达的A20细胞(P<0.05)。与普通A20细胞荷瘤组相比,pd-l1干扰荷瘤组小鼠外观及活体荧光成像均可见其瘤体显著缩小。小鼠解剖后称取瘤重,测量瘤体积,结果显示,瘤重及瘤体积明显缩小(P<0.05)。小鼠生存期也较pd-l1高表达组有一定延长。结论:pd-l1在淋巴瘤的发生发展中起到重要作用,干扰其表达能抑制细胞的体外增殖,对于瘤体的生长有一定的抑制作用。

摘要：肝细胞癌(HCC)是世界上最具侵袭性的实体恶性肿瘤之一,尽管近几十年来在肝切除术、射频消融和肝移植等方面取得了显著进展,但HCC患者的愈后仍不乐观,主要原因是HCC的高复发率和转移率以及该疾病对化疗和靶向治疗的耐受性。VEGFR2和pd-l1抑制剂联合应用能对小鼠体内的HCC肿瘤进行显著抑制并延长其寿命,因此开发VEGFR2与pd-l1双靶点抑制剂对HCC的治疗具有十分重要的意义。本文基于计算机辅助药物设计(CADD),经过以分子对接为基础的虚拟筛选、MM-GBSA和ADMET评价以及QSAR模型预测,得到了一系列VEGFR2和pd-l1的双靶点活性化合物,有望为后续抑制剂的开发提供思路和方向。

摘要：为了比较内源性的3-硝基酪氨酸与非天然的4-硝基苯丙氨酸在pd-l1疫苗中的引入对T细胞亚群分化的影响,利用遗传密码扩充技术,将这两种免疫原性氨基酸分别引入到pd-l1疫苗的相同位点,获得具有3-硝基酪氨酸以及4-硝基苯丙氨酸的两种pd-l1突变体。用这两种突变体免疫小鼠,分析对小鼠脾脏T细胞亚群分化的影响。流式细胞术检测结果显示,4-硝基苯丙氨酸在pd-l1疫苗中的引入可促进Th1细胞的极化,同时降低Treg细胞的比例,3-硝基酪氨酸的引入对Th1细胞的极化无影响,同时能显著提高Treg和Th17细胞的比例。二者在pd-l1疫苗中的引入均能促进脾脏CD8+T细胞的应答,其中含有4-硝基苯丙氨酸的pd-l1突变体应答效果更强。实验结果表明,与内源性的3-硝基酪氨酸在pd-l1疫苗中的引入相比,非天然的4-硝基苯丙氨酸更适合用于肿瘤疫苗的设计。

摘要：程序性死亡受体1(pd-1)/程序性死亡配体1(pd-l1)信号通路主要参与免疫负调控作用,且在许多类型的肿瘤的恶性发展中具有关键作用。pd-l1的高表达可促进肝细胞癌(HCC)的侵袭,提高肿瘤复发的风险。另外,pd-l1常作为免疫检查点的阻断靶点,主要通过单抗将其中和,引发抗肿瘤免疫反应。因此,pd-l1是HCC免疫治疗中极具潜力的靶点之一。本文主要探究纳米级功能化氧化石墨烯(GO-PEI-PEG)携带pd-l1 siRNA对肝癌细胞的恶性生物学行为的影响。研究结果显示,将GO-PEI-PEG/pd-l1 siRNA转染至MHCC97H细胞后,细胞的增殖和迁移均被抑制,细胞周期阻滞在G1期,且细胞凋亡的数目增多。进一步研究发现,GO-PEI-PEG/pd-l1 siRNA对MHCC97H细胞的抑制作用是通过阻碍AKT信号通路激活实现的。这些试验结果表明,GO-PEI-PEG具备优秀的递送性能,携带pd-l1 siRNA可有效干扰pd-l1表达,进而抑制肝癌细胞的恶性生物学行为,这为治疗HCC提供了更安全、有效的递送新策略。