摘要：目的:制备血红素加氧酶-1(HO-1)融合蛋白pep-1-HO-1,观察融合蛋白在大鼠H9c2心肌细胞的转导。方法:设计合成hHO-1 PCR引物,扩增hHO-1 cDNA片段;采用PCR靶向克隆法将扩增产物与含有相同酶切位点载体质粒pET15b-pep-1进行重组,扩增质粒,双酶切鉴定和DNA测序;将测序和鉴定结果正确的重组质粒转化宿主菌Rosetta(DE3)pLysS,诱导表达融合蛋白pep-1-HO-1,利用表达蛋白N端的组氨酸"标签"(His-tag)进行亲和层析纯化融合蛋白;SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行定性检测,Bradford法定量检测纯化后蛋白;融合蛋白孵育大鼠H9c2心肌细胞,免疫组化法观察融合蛋白在H9c2细胞的转导和分布,分光度法检测蛋白转导后的活性。结果:hHO-1 cDNA与pET15b-pep-1重组成功,重组质粒pET15b-pep-1-hHO-1经酶切鉴定含有hHO-1 cDNA,测序分析证实与GenBank提供的原始序列完全一致;重组质粒转化后经诱导和纯化得到了融合蛋白pep-1-HO-1,浓度达到1.0 g/L;融合蛋白可以穿透H9c2心肌细胞胞膜,进入细胞后主要分布在胞质和胞核内并具有天然活性。结论:成功地构建了pET15b-pep-1-hHO-1原核表达质粒,获得了可穿透H9c2心肌细胞膜的血红素加氧酶-1融合蛋白pep-1-HO-1,为应用HO-1治疗缺血性疾病的研究奠定了基础。

摘要：目的:利用同尾酶技术构建pET15b-pep-1-CAT重组质粒,为制备pep-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础。方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDNA。将扩增的CAT cDNA与dATP反应,利用Taq DNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CAT cDNA的3′末端加"A"并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CAT cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中,经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子pGEM-T-CAT。人工合成编码pep-1的双链寡核苷酸,两端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-pep-1,然后酶切鉴定。pGEM-T-CAT和pET15b-pep-1分别经SalⅠ-BglⅡ和XhoⅠ-BamHⅠ双酶切,利用同尾酶(SalⅠ与XhoⅠ,BglⅡ与BamHⅠ)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CAT cDNA片段与pET15b-pep-1相连,构建出重组质粒pET15b-pep-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。结果:获得pET15b-pep-1-CAT重组子,经测序分析证实,克隆入pET15b的pep-1序列与设计合成的pep-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CAT cDNA序列一致。结论:pET15b-pep-1-CAT的成功构建为产生融合蛋白H is tag-pep-1-CAT进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定了基础。

摘要：目的构建pET15b-pep-1-SOD1原核表达质粒。方法通过设计含有特定酶切位点的引物,以含有全长人SOD1 cDNA的质粒(pBluescript II SK-SOD1)为模板,扩增出SOD1 cDNA,将SOD1 cDNA和人工合成的编码pep-1的双链寡核苷酸克隆至pET15b原核表达载体上,进行酶切鉴定及测序分析。结果pET15b-pep-1-SOD1重组质粒经酶切鉴定含有SOD1 cDNA和编码pep-1的片段,测序分析证实分别与GeneBank“AB087266”登录的人SOD1 cDNA和合成的pep-1编码序列完全一致。结论成功地构建了pET15b-pep-1-SOD1重组质粒,为制备pep-1-SOD1融合蛋白提供了表达载体。