摘要：目的:构建人perk基因的shRNA慢病毒载体,检测其对人牙髓细胞(dental pulp cells,DPCs)perk基因表达的抑制作用。方法:针对人perk基因的cDNA序列,设计并合成针对人perk基因的shRNA表达序列,将其连接到载体hU6-MCS-CMV-EGFP中。测序正确后,将构建的目的载体和包装质粒共转染293T细胞,72 h后收获并浓缩得到重组慢病毒颗粒。筛选最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI),将病毒感染人牙髓细胞,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)技术检测perk基因mRNA和蛋白的表达水平,验证干扰效果。采用SPSS24.0软件包对数据进行统计学分析。结果:成功构建LV-perk-RNAi慢病毒载体,病毒滴度为3×10~8 TU/mL,最适MOI=30;RT-PCR和Western印迹法检测显示,与空白对照组相比,perk基因的mRNA和蛋白质表达水平显著下降,在mRNA水平的表达抑制率约为63%。结论:成功构建perk干扰慢病毒表达载体,为后续的研究创造了条件。

摘要：利用新型CRISPR interference(CRISPRi)技术进行蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase, perk)目的基因perk的敲低。首先,利用慢病毒包装系统经嘌呤霉素筛选后构建稳定表达dCas9-KRAB蛋白的MDCK细胞株。然后,设计靶向perk转录起始位点(transcription start site, TSS)的特异性小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),向该稳转细胞株转染表达sgRNA的质粒,通过qPCR检测perk的mRNA表达水平;同时,内质网应激激活剂衣霉素(tunicamycin, Tu)处理该细胞后,通过qPCR检测perk通路下游GRP78、GRP94、ATF4、GADD34和CHOP等基因mRNA的表达水平。最后,将犬细小病毒2型(canine parvovirus type 2,CPV-2)接种于perk敲低的MDCK细胞株,通过绝对定量PCR测定不同时间点CPV-2的复制水平。结果表明,敲低perk基因表达后,CPV-2的复制水平显著下降,说明perk参与调控CPV-2的复制。以上结果为进一步探究内质网未折叠蛋白反应(endoplasmic reticulum unfolded protein response, UPR^(ER))对CPV-2复制的影响及病毒与宿主相互作用的分子机制研究奠定了基础。