摘要：目的明确perv的整合是否影响HEK293细胞中HERV-W各基因表达水平。方法根据GenBank中登录的基因序列,分别设计HERV-W gag、HERV-W pol、HERV-Wenv、syncytin-1和humanβ-actin引物,并分别建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,用于检测HEK293、HEK293-perv中各基因mRNA的表达。结果本研究建立的检测方法均具有良好的特异性、敏感性和稳定性,标准曲线的相关系数大于0.99,扩增效率介于95%~110%,可用于检测。结论检测结果经2^(-△△Ct)分析后,发现与对照相比,perv整合后的HEK293-perv中HERV-Wgag、HERV-Wpol、HERV-Wenv和syncytin-1 mRNA相对表达量分别升高37.08倍、42.56倍、2.49倍和13.17倍,为进一步明确perv在异种移植中的安全性提供参考。

摘要：参照GenBank已发表的猪内源性逆转录病毒(perv-A亚型)全基因序列,用软件DNAman分析perv-A亚型全基因序列单一酶切位点,设计3对特异性引物及1对套式引物,分4段从仅携带perv-A亚型毒株的广西巴马小型猪外周血淋巴细胞中扩增巴马小型猪perv(perv-A-BM)全基因组序列,并将4个覆盖全基因组序列的重叠基因片段,通过pMD 18-T中间载体依次连接并克隆到pBluescript II SK(-)载体上,构建全基因cDNA克隆。同时通过定点突变和化学合成的方法成功恢复perv-A-BM全基因cDNA克隆中存在的15个保守突变碱基,将突变后的perv-A-BM全长序列上传GenBank,登录号为HM159246。为便于鉴定将perv-A-BM全基因cDNA克隆第8408位碱基由A沉默突变为C,引入新的单一酶切位点Aat II,获得cDNA克隆的突变株。酶切鉴定及测序结果表明,perv-A-BM前病毒基因组全长8 774bp,分为两端的5′、3′非编码区(UTR)及中间的开放阅读框(ORF),编码gag、pol和env基因。与不同亚型标准株gag和pol基因的氨基酸序列具有较高同源性,而env基因的同源性则较低。本研究为下一步拯救出该病毒提供了可直接使用的全长cDNA真核表达质粒。

摘要：猪内源性反转录病毒(perv)是与猪-人异种移植病原安全性密切相关的一类病毒。env基因编码病毒的囊膜蛋白,它与病毒的亚型分类、宿主感染范围、细胞的嗜性以及对宿主细胞的感染机制、诱导宿主产生中和抗体等密切相关。本研究利用RT-PCR的方法,从五指山小型猪外周血淋巴细胞中扩增perv的囊膜蛋白基因并进行测序,随后用生物信息学相关软件和方法,对perv-Env蛋白二级结构及B细胞表位进行预测。经综合分析评价,结果发现perv-Env蛋白有18个可能的B细胞优势抗原表位区域,7个可能的糖基化位点。该分析预测结果不但有利于perv疫苗的设计、单抗及诊断试剂研制,而且将有助于分析Env蛋白的功能及perv对人源细胞的感染机制。