摘要：根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的CS中和表位区(499~789 aa)序列设计1对特异性引物,在其5′端分别引入BamHⅠ和HindⅢ,PCR扩增PEDV CS区。将扩增的CS片段插入至pBApo-EF1α_Pur_DNA真核表达载体的BamHⅠ和HindⅢ位点,然后扩增含CS区表达盒,将其插入至含猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)AD基因的prv转移质粒pG-AD-EGFP中,构建转移质粒pG-AD-CS-EGFP。利用转染试剂ZLip2000将伪狂犬病病毒(prv)三基因缺失毒株rprv NY-gE-/gI-/TK-基因组与转移质粒pG-AD-CS-EGFP共转染ST细胞,获得携带有TGEV AD、PEDV CS区和绿色荧光蛋白标记基因的重组病毒rprv-AD-CS-EGFP。扩增重组病毒rprv-AD-CS的表达盒,测序后进行遗传稳定性评价,同时将重组病毒rprv-AD-CS、亲本株Bartha-K61和prv强毒株分别接种小鼠,进行安全性评价。将该重组病毒与CRISPR/Cas9-EGFP敲除质粒共转染ST细胞,经3轮病毒空斑纯化获得无绿色荧光标记的重组病毒rprv-AD-CS。经Western blot和IFA证实rprv-AD-CS在ST细胞中能表达CS外源蛋白,具有良好的遗传稳定性和安全性。结果表明,成功构建共表达TGEV AD蛋白和PEDV S蛋白CS区的重组病毒株rprv-AD-CS,该重组病毒具有遗传稳定性和安全性,为开发安全、有效的预防TGEV、PEDV和prv感染的三联苗奠定基础。

摘要：试验旨在了解猪伪狂犬病毒(prv)感染宿主后炎症动态变化,以猪肾细胞为宿主,选用炎性通路中Toll样受体4(TLR4)、骨髓分化一级反应蛋白88(MyD88)、核因子kB(NF-kB)和炎症因子干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)为研究指标。通过prv感染PK-15细胞和BHK-21细胞,对比分析两者细胞感染量(TCID_(50))、细胞病变(CPE)和病毒载量;选取prv较敏感细胞,设计炎性通路因子特异性引物,用实时荧光定量PCR检测不同时间点TLR4、MyD88和NF-kB表达量,ELISA测定IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子含量。结果显示,PK-15细胞、BHK-21细胞的TCID_(50)分别为10^(-8.98)/0.1 mL和10^(-8.58)/0.1 mL;在感染prv第18 h均见典型CPE。PK-15细胞病毒载量较高,且18 h内PK-15的CPE程度与病毒载量呈正相关。与未感染的PK-15细胞相比,prv感染PK-15细胞后TLR4、MyD88和NF-kB表达量均在感染后0~6 h时升高,感染后第12 h时极显著降低(P<0.01);除IFN-β外的炎症因子含量总体呈先下降后上升趋势。研究表明,prv感染宿主过程中可引起TLR4-MyD88-NF-kB通路表达量升高,促进炎症因子变化抵抗病毒感染,TLR4-MyD88-NF-kB炎症通路在抗prv感染过程中发挥重要作用。

摘要：为探索猪血小板反应蛋白3(thrombospondin 3,THBS3)在prv复制中的功能,利用CRISPR/Cas9系统构建THBS3基因缺失的PK-15稳定细胞株。首先,根据THBS3基因序列和CRISPR/Cas9靶点设计原则设计并合成2对sgRNA序列,退火后连接到Lenti-CRISprv2慢病毒表达载体;与慢病毒包装质粒共转染人胚肾细胞(HEK293T)获得重组慢病毒,收集细胞上清并离心去细胞碎片后转导PK-15细胞,进行嘌呤霉素筛选获得THBS3敲除的PK-15细胞株;将重组病毒rprv-GFP接种至野生型和缺失型细胞评价病毒复制差异。结果显示,表达sgRNA的重组质粒构建成功;将收获的慢病毒转导细胞后通过筛选获得1株无THBS3蛋白表达细胞株(PK-THBS3-KO),通过测序发现外显子3有1个碱基的插入;感染试验显示,THBS3基因缺失后抑制了prv复制。结果表明,通过CRISPR/Cas9系统成功构建了PK-15的THBS3基因敲除的稳定细胞株,prv感染试验显示基因缺失后抑制了病毒复制。

摘要：根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病病毒(prv)的gE、gI基因序列、猪细小病毒(PPV)的E蛋白的基因序列、II型猪圆环病毒(PCV-2)的ORF2基因序列,分别设计并合成3对能特异性扩增prv、PPV、PCV-2的引物,通过DNAstar软件分析这3对引物不存在cross d im er。建立了PCR方法分别检测prv、PPV、PCV-2,然后通过条件的优化,建立了PCR同时检测prv、PPV、PCV-2的方法并研制出试剂盒。对试剂盒的特异性和有效期进行了研究。结果表明,该试剂盒具有很好的特异性,有效期在-20℃至少可以保存1年。

摘要：设计、合成了 1对特异性引物 ,以prv MinA和prv YueA株的病毒基因组为模板扩增gE的抗原表位基因 ,均获得了约 5 6 0bp的特异性产物 .将PCR产物克隆到pUCm T载体上 ,构建重组质粒pUCMAgE和pUCYAgE .经菌落PCR和质粒酶切鉴定后 ,将目的基因进行序列测定 .结果表明 :目的基因均由 5 5 8bp组成 ,编码 186个氨基酸 ;核酸序列和推导的氨基酸序列的同源性分析表明 ,prv YueA和prv MinA株具有相对较低的同一性 ,分别为 96 9%和92 5 % .

摘要：根据基因库中的猪伪狂犬病病毒(prv)各基因的序列,设计了与prv的 gB、gD、gE基因序列互补的3对引物。对样品中的prv DNA模板进行了多重PCR扩增及反应条件的优化,结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带,分别为549 bp(gB)、429 bp(gD)、366 bp(gE)。用这3对引物对三基因缺失疫苗毒的样品DNA模板进行多次多重 PCR扩增,均能稳定得到与设计相符合的2条特异性条带。敏感性试验结果表明,多重 PCR可以检测到 106 pg三基因缺失疫苗毒或756 pg prv野毒的核酸模板量。特异性试验结果表明,以正常对照细胞及猪圆环病毒和猪细小病毒DNA为模板进行多重PCR扩增,均无任何条带。

摘要：根据GenBank登录的猪伪狂犬病毒(prv)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的参考基因序列,设计3对引物分别用于扩增PCV2的ORF2基因、prv的gE基因、PRRSV的N基因的目的片段,通过优化反应中各个影响因素,建立了prv、PCV2、PRRSV的多重PCR(mPCR)检测方法。敏感性和特异性的结果表明,该方法对这3种病毒的最低核酸检出量分别为32.5(prv)、25.2(PCV2)、35.9pg(PRRSV)。该方法对猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒1型(PCV1)、大肠杆菌、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(TGE)等病毒的检测结果均为阴性。200份临床样品的多重PCR结果表明,PCV2感染率为80%(160/200),prv感染率为21%(42/200),PRRSV的感染率为78%(156/200)。200份临床样品主要为PCV2和PRRSV混合感染,阳性率达56.0%(112/200)。该方法的建立对这3种病毒病的早期快速检测和指导临床实践具有十分重要的意义。

摘要：为建立可以同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(prv)和猪圆环病毒2型(PCV2)的快速、敏感的检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的CSFV、PRRSV、prv和PCV2 4种病毒的基因序列设计引物和探针,建立了一种能够用于同时检测这4种病毒的多重荧光定量PCR方法,并对其反应条件进行优化。结果显示,4种病毒的标准曲线相关系数均达到0.98以上,具有良好的线性关系。对CSFV、PRRSV、prv和PCV2以外的其他病毒株核酸扩增均呈阴性,具有较强的特异性。灵敏度试验结果显示,该方法对这4种病毒的最低检测量均能达到10拷贝/μL。此外,该检测方法的批内和批间重复性试验变异系数均小于5%,表明所建立的方法具有很好的重复性。利用建立的方法对59例疑似猪繁殖障碍疾病样本进行检测,结果显示,单一病毒感染样本7例,阳性率为11.86%;2种或3种病毒混合感染阳性率为44.07%(26/59);无4种病毒同时感染的样本。以上结果表明所建立的检测方法具有快速、准确、特异性好、灵敏度高等特点,能够对CSFV、PRRSV、prv和PCV2病毒同时进行检测,可以用于相关疫情的监测及防控。

摘要：针对伪狂犬病毒gD基因的不同片段设计三对引物 ,分别进行PCR扩增用于猪伪狂犬病的诊断 ,扩增的三个片段的长度分别为 2 62bp、2 1 7pb以及 1 2 0 3bp的全基因。通过比较发现 ,这三种PCR诊断方法均具有很高的特异性和敏感性 ,但扩增gD基因内部 2 62bp的PCR诊断方法种具有突出优点 ,其退火与延伸合成一步 ,其操作可于 1h内完成 ,敏感性更高 ,更适于猪伪狂犬病的快速诊断。

摘要：为建立一种快速鉴别猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的方法,根据猪伪狂犬病毒(prv)全基因序列,并参照SA215、Bartha-K61疫苗株基因缺失位点特征,在单一检测野毒株与疫苗株的基础上,针对g E、g B和TK基因设计引物,首次建立了同时检测猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的多重PCR检测方法。通过一次PCR检测能区分感染野毒株、疫苗株SA215和Bartha-K61,且与猪圆环Ⅱ型病毒(PCV-2)、细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)无交叉反应。多次试验证明该方法简单、可靠且敏感度高,可用于科学研究和临床诊断等方面。