摘要：目的:构建人野生型亚细胞定位pten基因真核表达载体,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法:以胎盘组织RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增目的基因片段。PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-pten质粒,进行酶切鉴定和测序。以T-pten质粒为模板,利用PCR技术将核定位信号(NSL)加入pten序列。PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-NSL-pten质粒。真核表达载体pcDNA3.1及T-NSL-pten质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接,转化大肠杆菌,获得重组载体pcDNA3.1-NSL-pten,进行酶切和测序鉴定。结果:重组质粒PUM-pten酶切在1200bp处见目的片段,与预期结果符合。测序结果显示基因序列与目的基因完全一致;重组质粒PUM-NSL-pten酶切在1200bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与设计一致,核定位信号成功加入;重组质粒pcDNA3.1-pten酶切在1200bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与目的基因相同;重组载体pcDNA3.1-NSL-pten经双酶切和测序证实了其正确性EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切在1200bp处见目的片段,与预期结果一致。测序结果显示,核定位信号成功加入,其后是阅读框架正确的pten基因序列。结论:成功构建可表达亚细胞定位pten的真核表达载体pcDNA3.1-NSL-pten。

摘要：目的:构建人pten基因RNA干扰(RNAi)及其逃避RNAi策略结构(RESC)救援的慢病毒载体。方法:利用Invitrogen公司在线软件,针对已筛选确定的pten基因RNAi有效靶序列,设计并合成靶序列的oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XbaⅠ和XhoⅠ酶切后的pFLRu-GFP载体连接构建成pFLRu-U6-shpten慢病毒载体。在此基础上,引入外源设计的ptenmRNA,与经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后的pFLRu-U6-shpten载体连接,从而产生在同一个载体内兼有人pten基因shRNA及其救援cDNA同时表达的RESC慢病毒载体pFLRu-U6-rrshpten。2者均转入到大肠杆菌XL10感受态细胞,制备质粒并用酶切及测序鉴定。分别用pFLRu-U6-shpten、pFLRu-U6-rrshpten与pCMV-dR8.2ΔR和pCMV-VSV-G质粒共转染293T包装细胞,包装产生2种慢病毒,收集病毒上清,系列稀释法检测病毒悬液的滴度。结果:氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆、酶切鉴定、U6前引物测序鉴定结果显示pFLRu-U6-shpten和pFLRu-U6-rrshpten均为阳性克隆,且2种慢病毒的滴度分别为6.6×105和5.6×105pfu/mL。结论:成功构建出人pten基因RNAi及其RESC慢病毒载体。有效地避免了由于脱靶效应所引起的假阳性结果对实验的干扰,为研究pten基因功能提供了稳定的转染细胞载体。

摘要：目的：构建microRNA-21、pten基因真核表达载体pEGFP-N1-pre-试勉1、pEGFP-NI-pten及shRNA表达载体Psilencer4．1-CMV-mir21-shRNA、Psilencer4．1-CMV—FrrEN--shRNA。方法：根据microRNA-21、pten基因序列设计合成shRNA及PCR引物。

摘要：目的 构建子宫内膜癌pten基因968delA突变检测技术平台,为临床分析pten基因968delA突变与子宫内膜癌的相关性提供技术支持。方法 设计pten基因968delA位点的特异性硫化修饰引物,以本实验室前期构建的包含pten基因968delA位点的突变型质粒和野生型质粒为模板,进行高保真聚合酶介导的双向引物延伸反应,采用正交设计进行PCR条件优化,再将其优化后采用突变敏感性分子开关技术检测从南华大学附属第一医院收集的62例临床患者子宫内膜组织样本pten基因968delA位点突变。结果 突变敏感性分子开关技术检测pten基因968delA位点最佳PCR反应条件为:30个循环、模板DNA(10 ng/μL)0.3μL、引物(10μmol/L)0.5μL、退火温度61℃,灵敏度达10^(-3)ng/μL。62例子宫内膜癌组织与21例正常子宫内膜组织标本均未发现pten基因968delA突变。结论 成功构建了子宫内膜癌pten基因968delA突变检测技术平台,为该技术在pten基因968delA的突变筛查中的应用提供了依据。

摘要：目的　pten基因是位于染色体 10 q2 3 3位点的抑癌基因 ,编码一种双特异磷酸酯酶 ,其编码蛋白能减少磷酸酰肌醇 3,4 ,5 三磷酸 第二信使的产生 ,抑制 1 磷酸酰肌醇 3 激酶 /Akt信号的传导 ,从而对 1 磷酸酰肌醇 3 激酶 /Akt信号的下游功能起拮抗作用 ,进而起到抑制肿瘤生长作用。在人脑胶质类肿瘤中pten基因有较高的变异率 ,而且多发生在分化差、恶性程度高的胶质瘤中。目前对于小儿髓母细胞瘤中pten基因变异的研究尚未见报道。方法　设计 3对内含子和外显子重叠交搭的引物来扩增pten基因的第 5、8外显子 ,用多聚酶链反应 脱氧核糖核酸单链构型多态性分析的方法 ,对 34例儿童髓母细胞瘤、10例小脑星形细胞瘤和 5例正常对照脑组织中pten基因的第 5、8易突变外显子进行变异检测 ,以研究儿童髓母细胞瘤中pten基因重要功能外显子的突变率。结果　 10例小脑星形细胞瘤的exon5 1、exon5 2和exon8均无点突变的发生 ,仅有 1例髓母细胞瘤出现pten基因的纯合性缺失 ,缺失率为 2 9% (1/ 34) ;其余 33例髓母细胞瘤pten基因exon5 1检出 3例突变 ;pten基因exon5 2检出 4例突变 ;pten基因exon8(2 0 0bp)检出3例突变 ;髓母细胞瘤pten基因的合计变异率为 32 1% (11/ 34)。结论　儿童髓母细胞瘤pten基因第 5。

摘要：背景:第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,pten)是一种抑癌基因,可以通过调节PI3K/AKT/mTOR等信号通路在细胞增殖凋亡中起到作用。最新研究证实,pten可在脊髓损伤、周围神经缺损等骨科疾病中起到重要作用,而相关的细胞模型却鲜有报道。目的:构建携载大鼠pten基因的慢病毒载体,建立pten基因表达降低的RSC96施万细胞系模型。方法:设计大鼠pten基因RNAi序列,将其构建并包装成可转染的慢病毒,转染RSC96施万细胞后,通过RT-PCR检测RSC96施万细胞中pten基因的表达情况。结果:成功构建病毒滴度为8E+8TU/ml的pten-RNAi慢病毒,将其转染RSC9施万细胞后,细胞中pten基因的相对表达量为0.2322±0.0187,敲减效率为76.78%,与阴性对照慢病毒转染组(1.0044±0.0022)相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:成功建立pten基因表达降低的RSC96施万细胞系模型,为研究pten基因相关的创伤骨科、脊柱外科、手外科疾病提供实验基础。

摘要：目的构建包含与子宫内膜癌相关的pten基因3位点的重组p MD19-exon 5-exon 8载体。方法以健康人全基因组DNA为模板,设计2对有重叠区的特异性引物分别扩增pten基因的exon 5和exon 8片段,利用重叠PCR技术,将exon 5和exon 8片段进行连接,再将连接产物exon 5-exon 8片段插入p MD19-T质粒,构建成重组p MD19-exon 5-exon 8载体,转化入大肠埃希菌感受态细胞DH5α进行表达,利用菌液PCR和基因组测序进行鉴定。结果 exon 5-exon 8片段经凝胶电泳检测,可在1 253 bp处见一清晰的目的条带,pten基因融合重组质粒经菌液PCR及测序结果鉴定,均与预期结果一致。结论应用重叠PCR法将exon 5和exon 8片段进行融合,并成功构建了pten基因融合重组表达载体。

摘要：目的探讨通过RNA激活(RNAa)技术上调pten基因的表达对人膀胱癌BIU-87细胞增殖和凋亡的影响。方法设计靶向抑癌基因pten启动子DNA序列互补的双链RNA分子(dspten),转染入BIU-87细胞中,采用RT-PCR法及Western Blot检测pten基因mRNA及蛋白质的表达变化,MTT法检测BIU-87细胞增殖速度,流式细胞仪检测pten细胞凋亡率。结果dspten转染BIU-87细胞后能显著上调pten基因的mRNA和蛋白的表达,与空白对照组、阴性对照组相比,经dspten作用的BIU-87膀胱癌细胞增殖受到明显抑制,凋亡率较对照组明显升高(P<0.05)。结论RNAa技术能有效激活pten基因,使其表达上调并抑制膀胱癌BIU-87细胞增殖,诱导细胞凋亡,为膀胱癌的基因治疗提供了新的依据和方法。

摘要：长双歧杆菌可特异地定植于实体瘤低氧区,可用做肿瘤靶向性基因治疗的载体,而构建大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭质粒则被证明是外源基因在长双歧杆菌中稳定表达的有效途径。为了构建能在长双歧杆菌中稳定表达外源基因的穿梭质粒并检测携带抑癌基因的工程菌对小鼠实体瘤的抑制效果,利用软件设计并合成了48条部分序列相互重叠的引物,通过PCR合成了长双歧杆菌质粒pMB1序列及长双歧杆菌HU启动子区序列,插入克隆载体pMD18-T,构建穿梭载体pMB-HU,该载体可在大肠杆菌DH5α及长双歧杆菌L17中稳定复制。pten基因编码具有蛋白质和酯类双重特异性磷酸酶活性的抑癌因子。将pten基因cDNA序列插入载体pMB-HU中HU启动子下游,构建重组质粒pMB-HU-pten,电击转化长双歧杆菌后,Western blot检测表明,表达产物中存在55kDa的pten蛋白特异条带。抑癌试验表明:与对照组相比,携带pten基因的长双歧杆菌可显著抑制小鼠实体瘤的生长。上述结果为以长双歧杆菌为载体的实体瘤靶向性基因治疗研究奠定了基础。