摘要：目的:建立一种准确、快速地检测地黄Rehmannia glutinosa Libosch.轮纹病病原真菌草茎点霉Phoma herbarum的实时荧光定量pcr(qrt-pcr)方法。方法:基于GenBank数据库中草茎点霉的基因序列设计草茎点霉的特异性引物,并基于该引物制备重组质粒标准品,以标准品DNA优化qrt-pcr反应体系及构建qrt-pcr标准曲线。采用所设计的qrt-pcr体系及特异性引物,检测草茎点霉回接地黄叶盘后不同时间病原菌数量的动态变化。结果:设计得到的特异性引物PH.F10/PH.R10及所建立的qrt-pcr方法体系特异性强,敏感度高,检测地黄草茎点霉DNA的最低浓度为2.04×10^(-4)ng/μL。接种后24~48 h(Ct值<31.29)时草茎点霉开始侵染地黄,48 h后病情级别调查结果为1级,且随时间延续侵染量逐渐增加。结论:本研究所建立的qrt-pcr方法能对地黄病株中草茎点霉真菌数量进行快速、动态检测,可为地黄轮纹病的早期诊断和动态监测提供技术支持。

摘要：甘蔗镰孢菌(Fusarium sacchari)是引起毁灭性病害甘蔗梢腐病(sugarcane pokkah boeng disease, PBD)的主要病原菌之一。病原菌分泌的效应蛋白在病原与植物互作中发挥至关重要的作用。本研究基于课题组前期甘蔗镰孢菌全基因测序数据,设计基因特异性引物,通过RT-pcr扩增得到一个新的含CBM4;结构域的效应蛋白基因,并对其功能进行了初步探索。序列分析表明Fs11724基因开放阅读框822 bp,编码273个氨基酸,分子量为28.24 kDa,理论pI值为4.29,亲水性平均系数–0.072,属于亲水性分泌蛋白;通过农杆菌介导的烟草瞬时表达系统证实Fs11724抑制由BAX诱导的细胞程序性死亡,表明Fs11724具有潜在抑制寄主防御反应的毒性功能;同时,利用酵母分泌系统对其编码蛋白信号肽的分泌功能进行验证,确定该基因编码蛋白为典型分泌蛋白;qrt-pcr结果分析表明Fs11724在甘蔗镰孢菌侵染前、后期上调表达,表达量在168 hpi达到峰值。该研究表明Fs11724编码蛋白为甘蔗镰孢菌F. sacchari的一个效应蛋白,其信号肽具有分泌功能,并且可以在非寄主植物烟草上抑制BAX诱导的细胞坏死,在真菌侵染植物过程中显著表达,可能在调控植物免疫反应中发挥作用。研究结果为进一步研究病原–甘蔗互作,揭示甘蔗镰孢菌发病机制奠定基础。

摘要：为探究天农麻鸡腹脂沉积候选基因表达水平和腹脂率的关系,本研究屠宰126日龄天农麻鸡200只,剥离腹部脂肪并称重,按腹脂率高低排序,随机选取不同腹脂率的32只鸡,提取腹脂组织的总RNA并利用qrt-pcr定量检测10个脂肪沉积候选基因的表达量,分析各基因表达量与腹脂率的相关性,并统计候选基因表达量在高低腹脂率天农麻鸡腹脂中的差异性。结果表明,LPL、PLIN、FTO和PPARγ表达量随腹脂率增加而逐渐高表达,其中LPL、PLIN和FTO表达量与腹脂率呈显著正相关且表达量在极端组间差异显著,可能是正向调节天农麻鸡腹部脂肪沉积的重要候选基因。该结果为研究天农麻鸡腹脂沉积的遗传调控机制和筛选分子标记提供了科学依据。

摘要：为了特异扩增circRNA发生可变反向剪接环化事件时被包含的circRNA,准确分析目标circRNA的表达水平。首先通过生物信息学分析葡萄高可信度circRNA的可变反向剪接环化事件特征,提出一种适用于葡萄circRNA可变反向剪接环化事件的引物设计改良方法,即一端引物的3'端跨反向剪接位点3-4个碱基,并运用RT-pcr和qrt-pcr方法进行验证。结果表明,高可信度葡萄circRNA的来源基因中有21.7%存在可变反向剪接环化事件,可分为并列、交叉和包含关系。选取4组circRNA进行扩增,其中circRNA_4363、circRNA_6017、circRNA_6044和circRNA_7086分别被circRNA_4364、circRNA_6018、circRNA_6045和circRNA_7085包含,使用常规背向引物对被包含的4个circRNA进行RT-pcr可获得2条扩增条带,且qrt-pcr溶解曲线为双峰。通过应用改良引物对circRNA_4363、circRNA_6017和circRNA_7086进行RT-pcr和qrt-pcr可获得单一扩增产物。相较于常规背向引物,使用改良引物可以特异扩增发生可变反向剪接环化事件时被包含的circRNA,使其定量分析结果更加准确可靠。

摘要：建立一种阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)的快速、准确、灵敏度高、特异性好的qrt-pcr核酸检测方法。通过对云南流行AKAV毒株的S片段序列进行分析,设计引物和探针,经优化建立AKAV qrt-pcr检测方法。优化后的最佳退火温度为60℃,选择制备病毒标准品的AKAV地方毒株(编号55)TCID 50效价为10^-4.25,通过梯度稀释建立的标准曲线线性关系较好。本方法灵敏度高、特异性好,对不同分离毒株和田间样本检测的结果显示,本方法不仅可以用于实验室鉴定,还可以用于田间样品的临床检测。成功建立了阿卡斑病毒qrt-pcr检测方法。

摘要：为探讨超声、紫外线照射及加温等方法对质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1的影响,采用四因素三水平正交试验设计,以mcr-1阳性猪场废水样品为研究对象,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qrt-pcr)测定mcr-1基因绝对丰度,以处理前后mcr-1基因绝对丰度变化率为指标,考察不同因素及水平对mcr-1基因含量的影响。结果表明,超声对mcr-1丰度有显著影响,其次是温度、加温时间,而紫外线照射对mcr-1的影响甚微。当依次将样品进行超声30 min、紫外线照射15 min、温度40℃作用30 min时,会使mcr-1含量比对照组高5倍多。而当超声时间为15 min、同时提高温度至50℃作用30 min和60℃作用5 min时,可使mcr-1的含量分别降低20.5%和30.6%。可见,不同因素及水平的组合可对mcr-1基因的含量造成相反的影响。因此,在实际中应筛选最佳的条件以尽可能地降低mcr-1基因的含量,减少mcr-1基因的进一步污染和扩散。

摘要：为筛选紫玉兰‘红元宝’(Magnolia liliflora‘Hongyuanbao’)二次花芽分化阶段稳定表达的内参基因,该研究以‘红元宝’不同花芽分化时期的花芽和叶为材料,基于转录组数据,筛选出8个候选内参基因,即泛素酶基因(UBC)、肌动蛋白(ACT)、微管蛋白β链(β-TUB)、微管蛋白β-5链(β-TUB5)、微管蛋白α-3链(α-TUB3)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)、酰基载体蛋白2(ACP2)、酰基载体蛋白3(ACP3)。运用Primer Premier 5设计引物,简单克隆和熔解曲线验证引物特异性;利用qrt-pcr技术检测各个候选内参基因的表达情况,结合GeNorm、NormFinder、BestKeeper软件和RefFinder在线工具综合评估其表达稳定性,并通过目的基因TFL1的表达分析验证其可靠性。结果表明:(1)8个候选内参基因条带位置正确,熔解曲线呈单一峰,说明引物特异性良好。(2)β-TUB、β-TUB5和α-TUB3是‘红元宝’不同花芽分化时期较为稳定的内参基因,而UBC和ACT为稳定性最低的内参基因。(3)β-TUB5、α-TUB3、β-TUB及其组合的相对表达量趋于一致,而ACT和UBC并未对目的基因的表达量进行有效的标准化。因此,β-TUB、β-TUB5和α-TUB3可作为‘红元宝’二次花芽分化研究中稳定表达的内参基因。该研究结果将为木兰属植物二次成花分子调控机制研究提供依据。

摘要：浓缩丹宁(CT)和纯玉米型酒精糟能降低反刍动物肠道CH4的产量及其抗微生物及高脂成分。但浓缩丹宁和纯玉米型酒精对瘤胃内产甲烷菌的多样性的影响还未检测。试验旨在利用pcr梯度凝胶电泳(pcr-DGGE)和实时定量pcr(qrt-pcr)检测饲喂纯玉米型酒精糟(DDG)和从Acacia mearnsii提取的丹宁对瘤胃内产甲烷菌多样性的影响。试验用8头安装瘤胃瘘管的母牛,采用4×4拉丁方设计,共4期试验,每期35d。试验用处理日粮(DM):①对照组(Ctrl),0g DDG;②200g DDG;③400g DDG;④400g DDG+CT(25g)。在每期试验第25和28天的饲喂前从瘤胃4点采集食糜样。总DNA提取自瘤胃食糜中(如0.5mL液相+0.5g固相食糜混合)来获取16SrRNA基因扩增片段,pcr产物用于进行pcr-DGGE分析。pcr-DGGE检测的第1期和第2期的产甲烷菌形成一个簇,第3期和第4期的产甲烷菌形成另一个簇。通过对pcr-DGGE的所有25个条带进行鉴定,其中有16个条带成功克隆和测序。11个条带的测序结果表明,该微生物的基因与Methanobrevi-bacter sp.有97%～100%的相似性,序列的系统发育聚簇分析也证实了该结论。剩余条带同Methanosphaera stadma-nae进行聚簇分析。尽管日粮对总的产甲烷菌无影响,但增加DDG使条带4、5、6、7、9、11中的含量增加而条带16和18中的含量降低。所有处理日粮除400g DDG+CT外均有条带13和19,定量RT-pcr分析证实所有产甲烷菌基因的16SrRNA拷贝数在处理日粮间无差异。pcr-DGGE和RT-pcr结果说明包括DDG及DDG和CT混合物会改变瘤胃中产甲烷菌的多样性但不会改变瘤胃内产甲烷菌的16SrRNA总量,然而说明一些产甲烷的特定种属的拷贝数可以用于解释瘤胃产甲烷菌的多样性。

摘要：【目的】为筛选美国白蛾在不同温度处理、不同发育阶段、幼虫不同组织中稳定的内参基因,为美国白蛾相关的基因定量研究奠定基础。【方法】在美国白蛾转录组测序结果中筛选出8个候选内参基因GAPDH、ACT、RPL12、RPL18a、RPS16、EF1α、EF1β、18S rRNA,获得碱基序列。将以上序列进行克隆、测序、比对最终证明其为美国白蛾的基因且碱基序列正确,之后将其上传到NCBI获得登录号。设计以上8个候选内参基因的实时荧光定量pcr(qrt?pcr)引物,利用qrt?pcr技术测定8个候选内参基因在美国白蛾不同发育阶段(幼虫1~6龄)、不同温度处理下(-10、-5、0、25、35、40、45℃处理2 h)、幼虫的不同组织(头、肠道、脂肪体、马氏管、表皮)中的表达量,记录Ct值;然后通过ΔCt法、GeNorm、NormFinder和BestKeeper共4种方法对8个候选内参基因在不同条件下的Ct值进行统计分析,最后综合RelFinder选出最稳定的内参基因。通过GeNorm计算Vn/(n+1)最合适内参基因的数目。【结果】Ct分析表明,在不同发育阶段和在不同温度处理下表达最稳定的是RPL12;在幼虫不同组织中,最稳定的是RPS16。GeNorm分析结果与ΔCt分析结果相同。NormFinder分析表明,在不同的发育阶段和不同温度处理下最稳定的候选内参基因分别是RPL18a和EF1α;在幼虫组织中,最稳定的是ACT。BestKeeper分析认为,不同发育阶段,ACT、GAPDH不适合作为内参基因;不同温度处理下,ACT、RPL18a、RPL12、RPS16、EF1β不适合作为内参基因;在不同幼虫组织中,RPL18a、EF1α、EF1β、18S rRNA不适合作为内参基因。最后RelFinder综合评价显示,在不同的发育阶段最稳定的内参基因组合是RPL12和EF1β,最不稳定的是ACT;在不同的温度处理下,最稳定的内参基因组合是EF1α和GAPDH,最不稳定的是ACT;在不同组织中,最稳定的组合是ACT和RPS16,最不稳定的是RPL18a。经GeNorm软件计算,最合适的内参基因数目应该是2个。【结论】在美国白蛾不同发育阶段的基因定量研究中,建议以RPL12和EF1β作为内参基因;在不同温度处理的基因定量研究中,建议以EF1α和GAPDH作为内参基因;在幼虫不同组织的基因定量研究中,建议以ACT和RPS16作为内参基因。此外,亦初步说明了昆虫内参基因在不同试验条件下的不稳定性。

摘要：湿加松(Pinus elliottii×***)是我国南方重要的脂材兼用树种,为挖掘调控湿加松松脂产量的相关基因,在湿加松的产脂高峰期,选取生长量相近但产脂量显著差异的湿加松植株,采集次生木质部组织进行高通量测序,并结合萜类物质合成、转运通路进行分析。结果显示,测序共产生594 108 382条clean reads,经de novo拼接获得190 514条unigenes,有304个unigene与萜类物质的合成有关。经过差异表达分析,得到414个差异表达unigenes,其中183个上调表达,231个下调表达。利用qrt-pcr技术对筛选的基因进行表达量验证分析,发现细胞色素P450、ABC转运蛋白、双功能松脂醇落叶松醇还原酶(PLR)在高脂树中表达量升高,异戊烯基转移酶表达量在低脂树中表达量较高。本研究丰富了湿加松及松科植物的转录本信息,为进一步研究湿加松松脂产量差异的分子机理奠定了重要基础。